雷帕霉素聯(lián)合肝動脈化療栓塞術(shù)對兔肝移植瘤模型中相關(guān)因子表達(dá)的影響△

張君娜，蔡靜，宋華勇，吳濤

河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院1病理科，2腫瘤內(nèi)科，3影像科，河南 開封 475001

肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。數(shù)據(jù)顯示，2015年，全球因肝癌死亡病例達(dá)81.0萬人，僅次于肺癌[1]。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是一種從吸水鏈霉菌發(fā)酵液中分離的抗真菌抗生素[2]。近年來，研究證實RAPA在肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌及婦科腫瘤等多種腫瘤中具有較強(qiáng)的抑制腫瘤生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[3]。另外，RAPA具有不良反應(yīng)少的特點，可在不損傷正常組織細(xì)胞的情況下，阻斷雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。目前，僅在移植手術(shù)后的免疫抑制等方面展開了RAPA相關(guān)臨床試驗，而RAPA對惡性腫瘤抑制作用的具體機(jī)制尚不完全清楚[5]。本文擬通過建立肝移植瘤兔模型，研究RAPA通過經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化療栓塞術(shù)（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）給藥時，肝癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生 長因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）3種腫瘤生長相關(guān)因子的表達(dá)情況，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇購自河南省疾病預(yù)防控制中心的健康新西蘭大白兔，共21只，雌雄不限，體重（2.7±0.3）kg，實驗動物許可證號：SYXK（豫）2017-0009。兔VX2腫瘤細(xì)胞購自通派（上海）生物科技有限公司。雷帕霉素由杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)，表柔比星由山東新時代藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，絲裂霉素由海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)。HIF-1α、VEGF和MMP2免疫組化試劑盒均購自上海雅吉生物科技有限公司。實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）所需試劑和引物均購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立兔肝移植模型 恒溫37℃水浴解凍冰凍的VX2腫瘤組織，取魚肉樣解凍組織于由青霉素和生理鹽水配制的溶液（160萬U/dl）中，剪碎成約2 mm大小，用粗針穿刺注射入一只健康大白兔后腿肌肉深部。兩周后，取出新鮮VX2腫瘤組織剪碎成約2 mm大小，開始建模。水合氯醛麻醉后，實驗兔仰臥位固定，利多卡因局部浸潤，于劍突下切開約2 cm，暴露肝左葉，粗針穿刺置入2～3顆VX2腫瘤組織，使用明膠海綿止血。術(shù)后抗感染3 d。2周后行計算機(jī)斷層掃描（CT）檢查，20只實驗兔全部建模成功，肝臟內(nèi)存在腫瘤。

1.2.2 分組及治療方案 采用隨機(jī)數(shù)字表法將20只建模成功的實驗兔隨機(jī)均分為研究組和對照組。對照組給予表柔比星1 mg/kg+絲裂霉素0.2 mg/kg；研究組在對照組基礎(chǔ)上給予RAPA 1 mg/kg。所有實驗兔均以碘化油溶解藥物制成乳劑，經(jīng)TACE途徑給藥。TACE的具體操作方法：實驗兔常規(guī)麻醉（氯胺酮22 mg/kg）后固定于操作臺，穿刺股動脈，置入微導(dǎo)管，進(jìn)行肝總動脈造影，明確肝移植瘤大小、位置及滋養(yǎng)血管位置。再配合微導(dǎo)絲，將微導(dǎo)管置于腫瘤滋養(yǎng)血管，然后灌注化療栓塞藥物，當(dāng)腫瘤滋養(yǎng)血管完全栓塞、腫瘤內(nèi)造影劑濃集則停止注射。退出導(dǎo)管，壓迫穿刺點止血。

1.2.3 CT 測量腫瘤體積 分別于治療當(dāng)天、治療后3天及治療后7天，對模型兔肝腫瘤進(jìn)行CT平掃，測量最大截面的長徑和短徑，計算腫瘤體積。

1.2.4 免疫組化染色法檢測蛋白表達(dá) 第3次CT掃描后處死實驗兔，解剖肝臟，嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒操作，檢測肝癌組織中HIF-1α、VEGF和MMP2蛋白的表達(dá)水平，當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃顆粒即為陽性。采用圖像分析軟件分析相應(yīng)的光密度（optical density，OD）值，選擇圖像中的陽性區(qū)域，得出這些區(qū)域的平均OD值。每只實驗兔取3份標(biāo)本，每個切片隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行測量，取平均值。

1.2.5 RT-qPCR法檢測mRNA表達(dá) 取兔移植瘤組織100 mg充分剪碎研磨，然后加入1 ml Trizol勻漿，提取總RNA，然后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，置于-20℃冷凍備用。嚴(yán)格按照聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增操作流程繪制工作曲線、擴(kuò)增目的基因。3種待測的mRNA（HIF-1α、VEGF和MMP2mRNA）均以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA 作為內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt值表示目的mRNA的相對表達(dá)量。引物序列：GAPDH的上游引物為5'-CACCCACTCCTCTA CCTTCG-3'，下游引物為5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'；HIF-1α的上游引物為5'-CATGTTCCCTTCATCCAATG-3'，下游引物為5'-TGCAGGGTCAGCACTACTTC-3'；VEGF的上游引物為5'-AGGAGACAATAAAC CCCACG-3'，下游引物為 5'-CACACTCCAGGCTTTCATCAT-3'；MMP2的上游引物為 5'-ATGACATCAAGGGCATTCAA-3'，下游引物為5'-ACGATGTCCTGTGTGCAGAT-3'。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察給藥后兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積，檢測并比較兩組肝癌實驗兔移植瘤組織中HIF-1α、VEGF、MMP2蛋白及相應(yīng)mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，連續(xù)測量數(shù)據(jù)的比較采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肝癌實驗兔腫瘤體積的比較

治療后，兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F組間=3.461，P組間＜0.01）；兩組肝癌實驗兔不同時間點（治療當(dāng)天、治療后3天、治療后7天）的腫瘤體積比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且腫瘤體積均隨著時間的延長而逐漸增大（F時間=107.335，P時間＜0.01）；兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積在時間和組間上存在交互作用，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F交互=35.103，P交互＜0.01）。（表1）

表1 兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積變化（cm3，±s）

表1 兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積變化（cm3，±s）

組別對照組（n=1 0）研究組（n=1 0）4.6 5±0.7 5 4.6 9±0.6 3 7.4 0±0.5 2 6.4 0±0.3 9 9.6 5±0.8 8 7.9 0±0.4 6治療當(dāng)天治療后3天治療后7天

2.2 HIF-1α、VEGF和MMP2蛋白及mRNA相對表達(dá)量的比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，研究組兔肝移植瘤模型肝癌組織中HIF-1α、VEGF和MMP2蛋白的相對表達(dá)量均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。RT-qPCR結(jié)果顯示，研究組兔肝移植瘤模型肝癌組織中HIF-1α、VEGF和MMP2的mRNA的相對表達(dá)量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表2 兩組兔肝移植瘤模型肝癌組織中HIF-1α、VEGF和MMP2蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表2 兩組兔肝移植瘤模型肝癌組織中HIF-1α、VEGF和MMP2蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

組別對照組（n=1 0）研究組（n=1 0）t值P值1.9 8±0.0 9 1.7 3±0.0 9 6.2 1 1＜0.0 1 1.8 2±0.1 0 1.5 7±0.0 9 5.8 7 6＜0.0 1 2.0 6±0.1 1 1.7 3±0.0 9 7.3 4 2＜0.0 1 H I F-1 α V E G F M M P 2

表3 兩組兔肝移植瘤模型肝癌組織中H-IF-1α、VEGF和MMP2 mRNA相對表達(dá)量的比較（±s）

表3 兩組兔肝移植瘤模型肝癌組織中H-IF-1α、VEGF和MMP2 mRNA相對表達(dá)量的比較（±s）

組別對照組（n=1 0）研究組（n=1 0）t值P值1.2 5±0.0 9 1.1 4±0.1 2 2.3 1 9＜0.0 5 1.1 8±0.0 8 1.0 9±0.0 7 2.6 7 7＜0.0 5 1.2 2±0.1 1 1.0 6±0.0 8 3.7 2 0＜0.0 5 H I F-1 α m R N A V E G F m R N A M M P 2 m R N A

3 討論

2015年，中國肝癌新發(fā)病例數(shù)占全球肝癌新發(fā)病例總數(shù)的54.58%（46.61萬/85.40萬），但是，被明確診斷時，多數(shù)患者已錯過直接手術(shù)的機(jī)會，造成嚴(yán)重的社會健康負(fù)擔(dān)[1,6]。對于中晚期肝癌，介入治療成為了越來越重要的手段，臨床對介入方法和藥物的探索從未停止[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，RAPA不僅具有免疫抑制作用，還對包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用，成為研究熱點[8]。然而，國內(nèi)外對RAPA抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制的研究還相對較少，因此，本研究選取了HIF-1α、VEGF和MMP2三個常見的腫瘤相關(guān)因子進(jìn)行研究。

TACE是肝癌介入治療的經(jīng)典方法，可以選擇性中斷腫瘤血供，造成腫瘤組織缺血、缺氧，是減小腫瘤體積、提高手術(shù)切除率的重要方法，并有利于肝內(nèi)微小病灶的診斷和治療[9]。但是，缺血僅能暫時控制腫瘤的進(jìn)展，必須配合化療藥物，殺死腫瘤細(xì)胞，才能發(fā)揮更好的治療效果。本研究中，治療后，兩組的腫瘤體積均有所增大，Manjulika[10]的研究指出，肝癌組織邊緣與正常組織呈交錯生長，邊緣腫瘤細(xì)胞可以通過正常肝臟血竇汲取營養(yǎng)，提示通過TACE不可能完全阻斷肝癌的生長。本研究中，治療后，兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.461，P＜0.01），且均隨著時間的延長而逐漸增大（F=107.335，P＜0.01）。兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積在時間和組間上存在交互作用（F=35.103，P＜0.01），提示研究組的腫瘤增長速率明顯低于對照組，RAPA可以使TACE抑制腫瘤的效果更好。

HIF-1α在正常細(xì)胞中會被迅速分解，在腫瘤等缺氧細(xì)胞中能較穩(wěn)定地存在，是多種信號通路的重要物質(zhì)，能促進(jìn)缺氧狀態(tài)時腫瘤細(xì)胞中VEGF表達(dá)的上調(diào)，而后者可特異性增加血管通透性，改變血管基質(zhì)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖，從而促進(jìn)腫瘤新生血管的形成[11]。既往研究證實，TACE治療后，兔移植瘤模型中HIF-1α、VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)水平均明顯下降[12]。這是由于TACE可以阻斷腫瘤血供，抗腫瘤藥物可殺滅大部分活躍的腫瘤細(xì)胞，雖然術(shù)后腫瘤組織的乏氧情況加劇，但活躍的細(xì)胞數(shù)量卻明顯減少，從而總體下調(diào)了腫瘤生長相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[13]。本研究中，研究組肝癌組織中 HIF-1α、VEGF、MMP2蛋白及mRNA的相對表達(dá)量均低于對照組，提示RAPA聯(lián)合常規(guī)化療方案經(jīng)TACE給藥能更好地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性，這符合TACE治療中晚期肝癌效果的理論基礎(chǔ)[14]。

MMP2是一種蛋白水解酶，其催化位點包含3個纖維連接蛋白Ⅱ型重復(fù)序列，可以使變性Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原與彈性蛋白相結(jié)合，從而使細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解，進(jìn)而為腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件[15]。本研究中，研究組移植瘤組織中MMP2蛋白及mRNA的表達(dá)水平均低于對照組（P＜0.05），提示RAPA可能具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，與Dai等[16]的研究結(jié)果類似。

綜上所述，RAPA聯(lián)合常規(guī)化療藥物在抑制兔肝移植瘤生長及HIF-1α、VEGF、MMP2因子的表達(dá)方面優(yōu)于僅用常規(guī)化療方案。但是，本研究尚存在不足之處，一是未能檢測兩組實驗兔治療前后肝功能的變化情況，無法了解聯(lián)合治療是否會增加肝衰竭的發(fā)生風(fēng)險；二是未對治療后移植瘤邊緣的浸潤情況進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，無法了解聯(lián)合治療是否會增加腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生風(fēng)險。本研究在分子水平變化方面的結(jié)果為臨床提高肝癌TACE的治療效率提供了參考，在下一步實驗中爭取彌補(bǔ)不足，取得進(jìn)展。