宮頸鱗狀細胞癌對DDP和DDP+5-FU 的體外藥敏檢測及與耐藥蛋白表達的關(guān)系研究△

蘇豐麗，孔為民#，劉志茹，宋丹，卞麗紅

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100006

2北京美中宜和婦兒醫(yī)院婦科，北京 100015

3解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心婦科，北京 100071

子宮頸癌是全球女性第四大常見惡性腫瘤，約90%發(fā)生在中低收入國家[1]。2019年美國宮頸癌新增病例和死亡人數(shù)已呈下降趨勢[2]，而在不發(fā)達國家宮頸癌的5年生存率仍不足50%[3]，嚴(yán)重威脅著女性健康，因此宮頸癌的治療仍是全球醫(yī)療研究的熱點。20世紀(jì)90年代，在發(fā)表了五項大型臨床試驗后，美國國家癌癥研究所批準(zhǔn)以順鉑為基礎(chǔ)的同步放化療成為中晚期宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。目前臨床上同步放化療的常用化療方案為順鉑（cisplatin，DDP）和DDP+5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU），這也是美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南所推薦的方案，但哪種方案療效好還有爭議，因此本研究采用三磷酸腺苷生物熒光法（triphosadenine bioluminescence tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA）對這兩種常用化療方案進行藥敏檢測，比較其體外有效率。同時檢測其耐藥蛋白P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶-π（glutathione S-transferase-π，GST-π）、DNA 拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（topoisomerasⅡ，TopoⅡ）、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）的表達，分析化療藥物敏感性與耐藥蛋白表達的關(guān)系，為臨床預(yù)測化療藥物耐藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2019年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院初治的宮頸鱗狀細胞癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理證實為宮頸鱗狀細胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有放化療史；合并心肝腎等重要臟器疾病；合并其他腫瘤。共納入35例宮頸鱗狀細胞癌患者，年齡29～71歲，中位年齡52歲；臨床分期采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期14例，ⅡA期10例，ⅡB期8例，Ⅲ期2例，Ⅳ期1例；分化程度：高分化5例，中分化28例，低分化2例。取材前均經(jīng)患者同意并簽署知情同意書。

1.2 主要藥物、試劑和儀器

DDP、5-FU血漿峰值濃度（peak plasma concentration，PPC）分別為：2.5μg/ml、22.5 μg/ml，根據(jù)參考文獻[4-6]提供的PPC，100%試驗藥物濃度（test drug concentrations，TDC）為PPC。聯(lián)合藥物方案中每種藥物的TDC與單藥試驗相同。

ATP-TCA法藥敏檢測試劑盒購自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；鼠抗人P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS單克隆抗體，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑，EnⅤision二步法試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。MPL1型生物熒光測定儀購自德國Berthold公司。

1.3 實驗方法

將新鮮宮頸癌組織分成兩部分，其中一部分行快速病理及免疫組化檢測耐藥蛋白，另一部分立即送往無菌實驗室，參考文獻[7]的實驗步驟制成單細胞懸液。將化療藥物分別設(shè)置5個稀釋濃度，分別為200%、100%、50%、25%、12.5%，稀釋至48孔板中，每孔設(shè)置2個平行孔，其余孔分別用于無藥物處理和空白對照。在每個孔中加入單細胞懸液（2～3）×104/ml，將培養(yǎng)皿置于5% CO2、37 ℃、95%以上濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。各孔加ATP提取液50 μl，混勻后取50 μl混合液于檢測板，加入50 μl熒光酶-熒光素工作液，將檢測板置于熒光檢測儀內(nèi)進行檢測。熒光檢測儀自動計算每種藥物各個濃度的腫瘤生長抑制率、半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）和IC90，繪制腫瘤抑制曲線圖，從而判定藥物敏感程度。

1.4 腫瘤組織對化療藥物的敏感性檢測

評價標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[8]。高度敏感（SS）：IC50≤25% TDC且IC90≤100% TDC；中度敏感（IS）：IC50≤25% TDC且IC90＞100% TDC；輕度敏感（MS）：IC50＞25% TDC 且 IC90≤100% TDC；耐藥（R）：IC50＞25% TDC且 IC90＞100% TDC。體外有效率=（SS+IS）/（SS+IS+MS+R）×100%。

1.5 免疫組化法檢測蛋白表達情況

采用EnⅤision二步法檢測宮頸鱗狀細胞癌中P-gp、GST-π、TS、TopoⅡ蛋白的表達情況，每批切片均設(shè)陽性對照及陰性對照，用已知P-gp、、GST-π、TS、TopoⅡ的陽性宮頸癌切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.6 免疫組化結(jié)果判定

P-gp、GST-π、TS蛋白的判定標(biāo)準(zhǔn)：“-”，陽性細胞＜10%；“+”，陽性細胞為10%～25%；“++”，陽性細胞＞25%且≤75%；“+++”，陽性細胞＞75%。TopoⅡ蛋白的判定標(biāo)準(zhǔn)：“-”，陽性細胞＜25%；“+”，陽性細胞為25%～50%；“++”，陽性細胞＞50%且≤75%；“+++”，陽性細胞＞75%。本研究以“-”為陰性，“+～+++”均為陽性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 9.4軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；多因素分析采用Logistic回歸分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATP-TCA體外藥敏實驗結(jié)果

35例標(biāo)本均進行藥敏實驗，DDP的體外有效率為37.14%（13/35），與DDP+5-FU的51.43%（18/35）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.447，P＞0.05）（表1）。經(jīng)多因素分析發(fā)現(xiàn)，患者年齡、臨床分期、分化程度均不為DDP、DDP+5-FU藥物敏感性的影響因素（P＞0.05）（表2）。

表1 宮頸鱗狀細胞癌對兩組化療藥物的體外藥敏實驗結(jié)果

表2 化療藥物敏感性影響因素的多因素分析

2.2 耐藥蛋白表達與體外藥物敏感性的關(guān)系

P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS蛋白陽性表達率分別為57.14%（20/35）、51.43%（18/35）、71.43%（25/35）、57.14%（20/35）。GST-π蛋白陽性表達是宮頸鱗狀細胞癌對DDP耐藥的影響因素（P=0.002）；TS蛋白陽性表達是宮頸鱗狀細胞癌對DDP+5-FU耐藥的影響因素（P=0.001）；P-gp、TopoⅡ蛋白陽性表達與宮頸鱗狀細胞癌對DDP、DDP+5-FU耐藥敏感性無關(guān)（P＞0.05）。（表3）

表3 耐藥蛋白表達與DDP、DDP+5-FU藥物敏感性關(guān)系的多因素分析

3 討論

3.1 宮頸鱗狀細胞癌ATP-TCA 體外藥敏實驗的臨床意義

ATP-TCA技術(shù)是目前應(yīng)用較廣泛、較成熟的一項的體外藥敏檢測方法。其原理是在生理條件下，ATP是活細胞能量代謝的來源，細胞凋亡后會迅速水解消失，而ATP在熒光素-熒光素酶復(fù)合物的作用下釋放螢光（波長為562 nm），檢測螢光強度，即可測出ATP含量即活細胞數(shù)量。研究表明，ATP-TCA的體外藥敏檢測結(jié)果與臨床療效及生存率具有較好的相關(guān)性[9]?；熐皩熕幬镞M行體外藥敏檢測可有效預(yù)防原代耐藥的發(fā)生和不適當(dāng)藥物的治療[10-11]。本課題前期劉志茹和孔為民[12]的研究已證實ATP-TCA法用于檢測宮頸癌體外藥物敏感性具有可行性。

DDP與DDP+5-FU是臨床中晚期宮頸癌同步放化療中最常用的兩種化療方案，DDP與5-FU均具有放射增敏作用，在放化療中起到協(xié)同及互補的治療效果。DDP屬于細胞周期非特異性藥物，藥物進入細胞核作用于DNA分子后可形成Pt-DNA化合物，阻斷DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致細胞死亡。DDP是濃度依賴性抗腫瘤藥，濃度越高，療效越好，而且在臨床上宮頸癌治療中順鉑的毒性可控[12]，較為安全。5-FU是細胞周期特異性抗代謝類抗惡性腫瘤藥物，作用于細胞S期。近年來研究發(fā)現(xiàn)5-FU在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU脫氧核苷酸、5-FU核苷等代謝產(chǎn)物，從而影響或干擾DNA及蛋白質(zhì)的合成，起到抗腫瘤作用。5-FU具有時間依賴性，持續(xù)給藥能提高療效。本研究結(jié)果顯示，單藥DDP體外有效率為37.14%（13/35），DDP+5-FU聯(lián)合應(yīng)用體外有效率為51.43%（18/35），聯(lián)合用藥體外有效率略高于單藥，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Kim等[13]一項隨機對照試驗，比較DDP+5-FU與單藥DDP聯(lián)合放療治療局部晚期宮頸癌（ⅡB～ⅣA期）的療效，聯(lián)合組、單藥組患者3個月完全緩解率分別為96%和88%，4年總生存率分別為64%和54%，無病生存率分別為77%和66%。2級以上血液毒性發(fā)生率分別為29%和15%，兩組患者反應(yīng)性、生存率和急性毒性發(fā)生率比較，無顯著差異。Kim等[14]的又一項前瞻性隨機對照研究，納入研究對象為155例局部晚期宮頸癌患者，比較DDP+5-FU與單藥DDP聯(lián)合放療治療局部晚期宮頸癌的療效，隨訪時間39個月，兩組患者的依從性分別為60%、71%，完全有效率分別為91%、91%，4年總生存率分別為70%、67%，無進展生存率分別為67%、66%，每周使用DDP周療聯(lián)合放療方案可顯著提高治療依從性，降低急性血液毒性，但不能提高生存率。Sonoda等[15]回顧性分析了91例ⅠB1～ⅣA期同步放化療的宮頸癌患者的病歷資料，比較DDP+5-FU 3周療法和DDP周療的療效，兩種方案療效相似，但DDP單藥周療的不良反應(yīng)耐受較好。但是Nedovic等[16]對134例局部晚期宮頸癌患者的研究顯示，DDP+5-FU聯(lián)合放療治療比單純DDP聯(lián)合放療更有效，2年復(fù)發(fā)率低。因此還需要大樣本的前瞻性研究。

本研究發(fā)現(xiàn)DDP與DDP+5-FU體外藥物敏感性與臨床特征如患者年齡、臨床分期、分化程度無關(guān)（P＞0.05）。由于本研究樣本量偏少，統(tǒng)計結(jié)果可能出現(xiàn)偏倚，并且體外實驗?zāi)[瘤細胞所處環(huán)境單一，腫瘤細胞完全浸泡于化療藥物中，而人體內(nèi)環(huán)境相對復(fù)雜，藥物入血后也產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng)，因此體外實驗?zāi)芊裾嬲从丑w內(nèi)情況還需要進一步研究。

3.2 體外藥物敏感性與耐藥蛋白P-gp、GST-、TopoⅡ、TS 表達的關(guān)系

多項研究已表明，腫瘤組織中P-gp、GST-π、TS及TopoⅡ的表達與腫瘤耐藥密切相關(guān)，其中以MDR1基因編碼的P-gp就是一種多藥耐藥蛋白。Penson等[17]研究發(fā)現(xiàn)P-gP的高表達與腫瘤患者的生存率呈明顯負相關(guān)。TopoⅡ是一種重要的核酶，能切斷超螺旋狀態(tài)的DNA雙鏈，改變DNA拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等生理功能。TopoⅡ是腫瘤化療過程中重要的靶酶，高表達對化療藥物敏感，低表達使細胞毒性降低，甚至耐藥。本實驗結(jié)果顯示，P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS蛋白陽性表達率分別為57.14%（20/35）、51.43%（18/35）、71.43%（25/35）、57.14%（20/35）。由此可見宮頸癌組織在未接受化療前已產(chǎn)生耐藥蛋白，說明宮頸癌組織本身存在一種或多種耐藥機制。本研究對象對TopoⅡ介導(dǎo)的原發(fā)耐藥相對偏低，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，P-gp、TopoⅡ蛋白表達與宮頸鱗狀細胞癌對DDP、DDP+5-FU耐藥無關(guān)（P＞0.05）。

GST-π主要功能為保護氧化劑對巰基的氧化，保護細胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和酶不被破壞。目前越來越多的證據(jù)支持，GST-π在多種腫瘤中過表達，如非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等。研究發(fā)現(xiàn)[18]谷胱甘肽對DDP有解毒功能，也是使其耐藥的原因之一。本實驗分析發(fā)現(xiàn)GST-π蛋白高表達與宮頸癌DDP耐藥有關(guān)。因此推斷GST-π蛋白表達可能是導(dǎo)致宮頸癌對DDP耐藥的重要原因。TS是DNA合成所必需的酶，5-FU是通過對TS蛋白的抑制而發(fā)揮其抗癌活性。研究發(fā)現(xiàn)[19]，TS的高表達與氟尿嘧啶耐藥有關(guān)，5氟尿嘧啶就是通過對TS蛋白的抑制而發(fā)揮其抗癌活性。Oguri等[20]研究發(fā)現(xiàn)，TS和細胞內(nèi)代謝酶的表達與5-FU的敏感性和（或）耐藥性有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，TS蛋白的表達與DDP+5-FU的耐藥有關(guān)。因此推斷，TS蛋白高表達可能是導(dǎo)致宮頸癌對DDP+5-FU耐藥的重要原因。

綜上所述，中晚期宮頸癌同步放化療中常用的兩組化療方案DDP及DDP+5-FU的ATP-TCA法體外有效率無顯著差異。研究組還將繼續(xù)進行體內(nèi)的研究及大樣本的臨床病例的回顧性及前瞻性對比觀察。GST-π、TS耐藥蛋白陽性表達可用于臨床宮頸鱗狀細胞癌患者對DDP、5-FU化療耐藥的預(yù)測指標(biāo)，從而避免盲目用藥，造成醫(yī)療資源浪費及產(chǎn)生不必要的化療不良反應(yīng)。