離子色譜-積分脈沖安培法在紙漿纖維單糖組成分析中的應(yīng)用

鄭泉興 張建平 李巧靈 劉秀彩 黃朝章 藍(lán)洪橋許寒春 于德德 劉 雯 葉仲力 劉江生 伊?xí)詵| 李 斌 謝 衛(wèi)，* 鄧 楠，*

（1.福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，福建廈門，361021；2.廈門大學(xué)化學(xué)系，福建廈門，361005；3.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南鄭州，450001）

植物纖維是地球上儲量豐富的可再生資源，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3 種高分子聚合物組成[1-3]。其中，纖維素是由β-1,4-糖苷鍵連接成的脫水葡萄糖組成的線性聚合物，而半纖維素比纖維素復(fù)雜得多，是由戊糖（木糖和阿拉伯糖）、己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）和己糖酸（4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖醛酸）等單元組成的具有一些分支的雜多糖，這些官能團(tuán)可以組裝成各種半纖維素多糖，具有從線性到高度分支的不同結(jié)構(gòu)，如β-1,4-D-聚木糖、阿拉伯糖基聚木糖、聚甘露糖、聚葡萄糖、聚半乳糖、半乳糖葡萄糖聚甘露糖等，而這些半纖維素多糖的詳細(xì)糖組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)因植物的種類而異[1,4]，如闊葉木半纖維素的主鏈主要由通過β-1,4-糖苷鍵連接的木糖單元組成，針葉木半纖維素主要由半乳糖-葡萄糖-聚甘露糖以及阿拉伯糖-葡萄糖醛酸-聚木糖組成[4]。而木質(zhì)素是由苯丙烷衍生物單體（如香豆醇、松柏醇和芥子醇）構(gòu)成的一種具有高度支鏈的芳香族高分子化合物，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子質(zhì)量大[1]。

由于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之間存在復(fù)雜的連接關(guān)系，完全分離這3種組分仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。目前，造紙行業(yè)通常采用“硝酸-乙醇法”來測定纖維素含量， 采用12% 鹽酸水解法（GB/T 2677.9－1994）來測定半纖維素或聚戊糖含量，采用72%硫酸法（GB/T 2677.8－1994）和紫外分光光度法（GB/T 10337－1989）來分別測定酸不溶木質(zhì)素和酸溶木質(zhì)素的含量[1,5-6]。然而這些方法的缺點(diǎn)是操作繁瑣，并且不能有效地區(qū)別半纖維素的結(jié)構(gòu)組成。美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）開發(fā)了采用兩階段酸水解進(jìn)行系統(tǒng)分析纖維中3大組分含量的方法[7]，該方法先在低溫下使用高濃度硫酸將纖維轉(zhuǎn)化為低聚糖，然后在高溫下使用稀酸將低聚糖進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為單糖，通過高效液相色譜對單糖進(jìn)行分析來確定纖維素和半纖維素的含量，并且通過稱量濾渣質(zhì)量以及對酸水解液采用UV 檢測來分別確定酸不溶木質(zhì)素和酸溶木質(zhì)素的含量，該方法操作簡便，被國際上各研究機(jī)構(gòu)廣泛采用[7-8]。

目前，針對糖的檢測主要有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10]等，但氣相色譜法需將糖轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的衍生物才能分析，而液相色譜法多采用靈敏度較低的示差折光檢測器（如NREL 所采用方法），這兩種方法都增加了單糖分析的復(fù)雜性和難度。而高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培法是近年來新發(fā)展起來的一種用于糖分析的方法，該方法在強(qiáng)堿性介質(zhì)中，用高效陰離子交換柱分離糖類，然后對糖分子結(jié)構(gòu)中的羥基在金電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電流實(shí)現(xiàn)檢測[11-12]，該方法前處理簡單，而且采用靈敏度高、選擇性高的脈沖安培檢測器，具有較高準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)受到科研工作者的廣泛關(guān)注。柴銀等人[11]采用離子色譜法測定牛蒡多糖的單糖組成；樂勝鋒等人[12]利用離子色譜法測定了蘆薈多糖中的7 種單糖含量；Chai 等人[13]采用離子色譜法測定了三倍體楊纖維的單糖組成。

本研究采用高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培法建立了單糖的檢測方法，對紙漿纖維的單糖組成差異進(jìn)行定性與定量分析，為造紙用纖維組成的解析提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

針葉木纖維（瑞典森林漿，云杉）、闊葉木纖維（巴西金魚闊葉木漿，桉木）、亞麻纖維（西班牙賽利莎亞麻漿），杭州華豐紙業(yè)有限公司；竹纖維，重慶理文造紙有限公司；棉纖維、草漿纖維（龍須草），福建金閩再造煙葉發(fā)展有限公司。

采用的糖標(biāo)準(zhǔn)品包括：L-(+)-阿拉伯糖（99%,Macklin 公司）、D-半乳糖（99%，Macklin 公司）、葡萄糖（一水，分析純，國藥集團(tuán)）、D-(+)-木糖（≥99%, Macklin）、D-甘露糖 （99%，Macklin）、D-(+)-半乳糖醛酸（一水，97%～101%，上海沃凱化學(xué)試劑有限公司）、D-葡萄糖醛酸（98%, Macklin 公司）以及D-纖維二糖（98%, Macklin 公司）。其他試劑：無水醋酸鈉（≥99%，美國ACROS ORGANICS）、NaOH溶液（50%，F(xiàn)luka），實(shí)驗(yàn)用水均經(jīng)過0.22 μm 濾膜過濾過的二次蒸餾水（Milli-Q純水）。

儀器： ICS-3000 離子色譜儀（配有ASRS-300 4 mm 型抑制器、直流安培檢測器和電導(dǎo)檢測器）、Carbo PAC PA 10 色譜柱（2.0 mm×250 mm，帶PA 10保護(hù)柱2 mm×50 mm，美國戴安公司）；0.45 μm聚醚砜微孔濾膜（美國Agilent 公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國Millipore 公司）；BSA2245-CW 電子天平（感量：0.0001 g，德國賽多利斯公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)糖樣品（阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和纖維二糖）各50 mg（精確至0.1 mg）分別溶于蒸餾水中，然后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶內(nèi)定容，配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)糖儲備液。用移液管分別移取各標(biāo)準(zhǔn)糖儲備液10 mL 于100 mL 容量瓶中，超純水定容后配制成100 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋成濃度0.01、0.05、 0.1、 0.25、 0.5、 0.8、 1.0、 2.0、 4.0 和5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.3 樣品處理

按照參考文獻(xiàn)[7]中NREL 兩步酸解法的步驟進(jìn)行。稱取干燥后的纖維樣品0.3 g（記纖維干質(zhì)量m0），加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)72%硫酸，搖勻，于30℃水浴中加熱1 h，然后加入84 mL 水，溶液轉(zhuǎn)移至耐壓玻璃管里，置于滅菌鍋中，121℃下酸解1 h。所得的酸解溶液樣品采用砂芯漏斗過濾后，取一部分稀釋100 倍，用離子色譜來測定單糖和纖維二糖含量。每個紙漿纖維樣品酸解做二次平行實(shí)驗(yàn)，離子色譜檢測除特別說明外，均重復(fù)兩次，取平均值。由于單糖在酸性條件會進(jìn)一步水解成糠醛、5-羥甲基糠醛等造成單糖的損失，因此按照NREL 方法，每種紙漿纖維樣品均需要配制與之單糖組成比例相近的單糖回收標(biāo)樣，并在同樣的條件下進(jìn)行酸解反應(yīng)，做二次平行實(shí)驗(yàn)，計算單糖平均回收系數(shù)，用來校正纖維單糖含量。計算公式如式(1)和式(2)所示[8]。

單糖平均回收系數(shù)：

單糖含量：

式中，下標(biāo)i 代表各糖；Ri為單糖的平均回收系數(shù)；Ci,ICS為單糖回收標(biāo)樣酸處理后從離子色譜得到的濃度，μg/mL；Ci,known為單糖回收標(biāo)樣酸處理前的濃度，μg/mL；Si為纖維的單糖含量，%；Ci為各單糖從離子色譜得到的濃度，μg/mL；n為稀釋倍數(shù)；V為溶液總?cè)莘e，mL；m0為纖維絕干質(zhì)量，mg；f為各單糖的校正系數(shù)，其中五碳糖（木糖和阿拉伯糖）的校正系數(shù)為0.88（132/150，150 是五碳糖的相對分子質(zhì)量，132 是纖維上五碳糖基的相對分子質(zhì)量），六碳糖（葡萄糖、半乳糖和甘露糖）的校正系數(shù)為0.90（162/180，180 是六碳糖的相對分子質(zhì)量，162是纖維上六碳糖基的相對分子質(zhì)量）。

1.4 色譜條件

色譜柱：Carbo PAC PA 10 （2.0 mm×250 mm，帶PA 10 保護(hù)柱2 mm×50 mm）；檢測模式：積分脈沖安培檢測；工作電極：Au 電極；參比電極：AgCl/Ag；掃描電位采用戴安公司推薦的脈沖點(diǎn)位波形，見表1；流動相：A為超純水，B為高濃度NaOH溶液（200 mmol/L），C 為醋酸鈉溶液（1.0 mol/L），D 為低濃度NaOH 溶液（10 mmol/L）；流速0.25 mL/min；溫度20℃；進(jìn)樣量25 μL。流動相梯度洗脫程序見表2，主要分為 3 個階段：0～30 min 為低濃度 NaOH 洗脫階段，主要用來分離單糖；30～65 min 為高濃度NaOH洗脫階段，主要用來分離未完全解離的二糖；65～80 min為醋酸鈉和NaOH共同洗脫階段，主要用來分離糖醛酸樣品；80～95 min 為分離后高濃度NaOH沖洗柱子階段。

表1 分離糖的檢測波形

表2 高效陰離子色譜梯度洗脫程序 %*

2 結(jié)果與討論

2.1 離子色譜條件的優(yōu)化

由于中性單糖的解離常數(shù)（pKa 值）在12 左右（見表3），實(shí)際上是弱酸，在高pH 值條件下，它們能部分電離為陰離子并在陰離子交換柱上保留并分離。由于甘露糖和木糖、半乳糖和阿拉伯糖的pKa值很接近，因此考察了不同NaOH 洗脫液濃度對這幾個單糖的分離度以及峰形的影響，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，當(dāng)NaOH 濃度為20 mmol/L 時，除了阿拉伯糖，其他幾個單糖幾乎重疊在一起，分離度很差；當(dāng)NaOH 濃度為10 mmol/L 時，阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖可以完全分離，但是峰形較差，而木糖和甘露糖重疊成一個峰；當(dāng)NaOH 濃度從5 mmol/L 降低至3 mmol/L時，各單糖的保留時間逐漸增加，且木糖和甘露糖的分離度逐漸提高；當(dāng)NaOH 濃度為2 mmol/L時，5 種單糖峰形對稱，并且達(dá)到了完全分離，且保留時間隨pKa值的增大而減小。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，最終采用濃度為2 mmol/L 的NaOH 洗脫液來分離單糖。

表3 單糖25℃下的pKa值[14]

圖1 洗脫液中NaOH濃度對單糖分離的影響

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系考察

分別配置了濃度為0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0 和 5.0 μg/mL 的各糖標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，在相同條件下分別進(jìn)樣后，所得的譜圖以及各單糖的定性結(jié)果見圖2。以糖濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，得到相應(yīng)的線性方程以及相關(guān)系數(shù)，并且根據(jù)三倍信噪比（S/N=3）計算儀器檢出限。其線性關(guān)系和檢出限見表4。由表4 可知，各種糖在濃度0.01～1.0 μg/mL 范圍內(nèi)具有非常好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2最小值為0.9988。單糖的檢出限最小為阿拉伯糖和甘露糖（0.0022 mg/L），最大為葡萄糖（0.0046 mg/L）。

圖2 單糖混標(biāo)溶液的離子色譜圖

表4 單糖標(biāo)品的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢測限

2.2.2 重復(fù)性考察

以一定濃度糖（各個糖實(shí)際濃度見表5）的混合標(biāo)準(zhǔn)品為樣品，連續(xù)進(jìn)樣7次進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見表5。由表5 可以看到，保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD）最大為0.12%（葡萄糖），最小值為0.03%（葡萄糖醛酸），峰面積的RSD 值最大為甘露糖1.83%，最小為纖維二糖0.63%，表明該方法的重現(xiàn)性非常好。

2.2.3 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

采用對針葉木纖維分別添加3 種不同量的標(biāo)準(zhǔn)品糖（每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次），以分析其回收率，結(jié)果見表6。從表6 可以看到，糖的回收率良好，平均回收率在96.62%～102.42%，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度良好。

表5 單糖的保留時間和峰面積的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.3 紙漿纖維的單糖組成

表7 列出了幾種紙漿纖維的單糖組成。由表7 結(jié)果可知，各纖維的單糖組成中含量最多的均為葡萄糖，其來源主要是纖維中的纖維素[1,15]。其中，葡萄糖含量最高的為棉纖維，由于棉纖維的纖維素含量達(dá)到95%以上（葡萄糖基以β-1,4-糖苷鍵連接）[1]，這與實(shí)驗(yàn)得到的平均葡萄糖含量95.84%相吻合；亞麻纖維的葡萄糖含量達(dá)到92.19%，文獻(xiàn)報道亞麻原料的纖維素含量為65%～80%[16]，由于造紙的亞麻漿板經(jīng)過漂白和脫木素處理，從而導(dǎo)致纖維素的含量增加。其他纖維原料紙漿中的葡萄糖平均含量相差不大，順序依次為：闊葉木纖維（75.80%）＞針葉木纖維（74.56%）＞竹纖維（74.05%）＞草纖維（71.90%）。

除了葡萄糖，構(gòu)成紙漿纖維的單體組分還含有木糖、阿拉伯糖、半乳糖等單糖，且不同紙漿纖維間存在較大的差異，這是由于這些單糖來源于半纖維素的水解，而半纖維素的化學(xué)結(jié)構(gòu)因植物的種類而異[1,4]。由表7可知，針葉木纖維含有7.60%木糖和4.65%甘露糖，以及少量的阿拉伯糖（0.71%） 和半乳糖（0.29%），其中，甘露糖含量在6 種纖維中最高，這是由于針葉木纖維的半纖維素主要由半乳糖-葡萄糖-聚甘露糖組成，其主鏈由β-1,4-葡萄糖和甘露糖殘基聚合而成，α-1,6-半乳糖為其主要側(cè)枝；另外，針葉木纖維還有一部分半纖維素由阿拉伯糖-葡萄糖醛酸-聚木糖組成，其主鏈由聚木糖（吡喃木糖基通過β-1,4-糖苷鍵鏈接）構(gòu)成，葡萄糖醛酸作為側(cè)基連接到木糖基的O-2 位，阿拉伯糖基連接到木糖基的O-2 或者O-3 位[4]。闊葉木纖維的木糖（15.02%）含量高于針葉木纖維， 而阿拉伯糖 （0.01%） 和半乳糖（0.04%）顯著低于針葉木纖維，這是由于闊葉木纖維的半纖維素主要以聚木糖為主鏈，以半乳糖和葡萄糖醛酸為側(cè)基構(gòu)成[4]。竹纖維和龍須草纖維中含有較高的木糖和阿拉伯糖含量，其木糖含量分別為17.27%和17.19%，這是由于竹纖維和龍須草纖維的半纖維素主要是以聚木糖為主鏈，阿拉伯糖基和葡萄糖醛酸基分別連接到木糖基的O-2 和O-3 位構(gòu)成的多糖[17-18]。亞麻纖維的木糖和甘露糖含量分別為4.17%和0.09%，這是由于半纖維素主要由乙?；木€性聚木糖和葡萄糖-聚甘露糖構(gòu)成[16]。棉纖維含有0.214%木糖，主要來源于半纖維素里的木糖聚葡萄糖，該多糖是由β-1,4-聚葡萄糖骨架為主鏈，部分葡萄糖殘基的O-6 連接木糖構(gòu)成的[19]。表7 的纖維單糖組成與文獻(xiàn)報道的不一致，這是由于本研究采用的紙漿纖維原料都經(jīng)過脫木素處理，在脫木素的同時半纖維素也會發(fā)生酸性水解或堿性水解而損失[20]，其含量受原料化學(xué)制漿工藝條件決定。另外，纖維酸水解溶液中纖維二糖的含量均小于0.02%，說明纖維水解反應(yīng)比較徹底。

表6 針葉木纖維加標(biāo)平均回收率

表7 不同紙漿原料的單糖組成 %

3 結(jié) 論

本研究建立了離子色譜-脈沖安培法檢測紙漿纖維水解常見的單糖（阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖）、糖醛酸（半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）和纖維二糖的測定方法。

3.1 采用積分脈沖安倍為檢測器，以氫氧化鈉和醋酸鈉為洗脫液，在Carbo PAC PA 10 （2.0 mm×250 mm）色譜柱上進(jìn)行梯度洗脫時，分離得到8種糖組分，在濃度0.01～1.0 μg/mL 范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2＞0.9988，檢出限在0.0022～0.0046 mg/L 之間，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD）為0.63%～1.83%，平均回收率為96.62%～102.42%，滿足分析檢測要求。

3.2 采用該方法分析不同紙漿纖維的水解單糖組成，發(fā)現(xiàn)針葉木纖維（云杉）、闊葉木纖維（桉木）、竹纖維、亞麻纖維、龍須草纖維和棉纖維具有較大的差異。針葉木纖維由葡萄糖、木糖、甘露糖以及少量的阿拉伯糖和半乳糖組成；闊葉木纖維由葡萄糖和木糖以及微量的阿拉伯糖和半乳糖組成；竹纖維由葡萄糖、木糖以及少量的阿拉伯糖和半乳糖組成；亞麻纖維由葡萄糖和木糖以及微量的阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖組成；龍須草纖維由葡萄糖和木糖以及微量的阿拉伯糖和半乳糖組成；棉纖維主要由葡萄糖組成。