高糖微環(huán)境下小鼠晶狀體上皮細胞中賴氨酸乙?；牡鞍踪|(zhì)組學(xué)分析

韓笑，閻啟昌，王欣玲

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，遼寧省晶狀體學(xué)重點實驗室，沈陽 110005）

研究［1-4］顯示，翻譯后修飾 （post-translational modification，PTM） 是探索疾病發(fā)病機制和防治靶點的重要研究對象。其中，乙酰化在生物體的炎癥反應(yīng)［5］、腫瘤發(fā)展［6］、糖尿病進程［7］中起著關(guān)鍵作用［8］。乙酰化可以影響蛋白質(zhì)的各種生理過程 （細胞周期、線粒體生物學(xué)過程、染色質(zhì)重塑和核轉(zhuǎn)運等）［9］。

研究［10-12］顯示，白內(nèi)障是導(dǎo)致失明的主要原因之一。糖尿病性白內(nèi)障是1型糖尿病患者視力障礙的主要原因［13］。已有研究［14］顯示2型糖尿病患者白內(nèi)障發(fā)病率比正常人顯著增加?？梢姼邼舛妊鞘谴龠M白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的重要誘因。但糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機制尚未明確。目前，糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病機制和防治靶點研究主要圍繞長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）［15］、GLUT葡萄糖 轉(zhuǎn)運蛋白［16］和白蘆藜醇［17］等方面開展，但糖尿病性白內(nèi)障的表觀遺傳調(diào)控和蛋白質(zhì)組學(xué)改變尚不清楚。已有研究［18-20］證實PTM在糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病過程中起重要作用。本研究利用穩(wěn)定同位素標記氨基酸 （stable isotope labeling by amino acids，SILAC） 處理晶狀體上皮細胞，采用泛乙酰化抗體富集，進行高分辨率液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 （liquid chromatographymass spectro/mass spectro，LC-MS/MS） 分析和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘。

1 材料與方法

1.1 SILAC標記和高糖處理

小鼠晶狀體上皮細胞系α-TN4 （中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院晶狀體學(xué)重點實驗室提供）在37 ℃、95%空氣和5%CO2環(huán)境下使用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL潮霉素的DMEM培養(yǎng)基 （葡萄糖5.5 mmol/L） 培養(yǎng)。SILACTM蛋白定量試劑盒 （美國Thermo Fisher Scientific公司） 中重標同位素賴氨酸 （L-13C-Lysine/L-13C615N4-Arginine，13C-Lysine） 標記正常細胞；輕標同位素賴氨酸 （L-Lysine/L-Arginine，12C-Lysine） 標記高糖處理細胞。細胞在輕標和重標的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少6代 （超過97%的標記效率） 后，用45 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基處理輕標細胞24 h。處理后將2組細胞分別在輕標和重標SILAC培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。擴增到所需數(shù)目后收集細胞，冷PBS洗滌2次，然后液氮快速冷凍收集。

1.2 蛋白質(zhì)提取和乙酰化免疫沉淀 （immunoprecipitation，IP） 富集

將重標和輕標的晶狀體上皮細胞等量混合，裂解緩沖液裂解后使用2-D Quant試劑盒確定蛋白質(zhì)濃度。應(yīng)用測序級的修飾胰蛋白酶 （美國Promega公司） 水解總蛋白。使用Agilent 300 Extend C18色譜柱，通過高pH反向高效液相色譜 （high performance liquid chromatography，HPLC） 分離肽。分 離出80個組份后再融合成18個組份進行全蛋白測序；同樣方法另外分離出80個組份融合成10個組份進行乙?；疘P富集。肽段溶解在IP緩沖液中，然后使用高質(zhì)量的泛乙酰化抗體偶聯(lián)樹脂 （抗體偶聯(lián)的瓊脂糖珠）進行乙?；亩胃患?，并在真空下冷凍干燥來進行LC-MS分析。

1.3 LC-MS/MS和數(shù)據(jù)庫搜索

通過超高性能液體分離系統(tǒng)EASY-nLC1000將肽段注射到納升電噴霧源中進行串聯(lián)質(zhì)譜 （mass spectro/mass spectro，MS/MS） 分析。質(zhì)譜 儀Thermo ScientificTMQ ExactiveTMPlus （美國Thermo Fisher Scientific公司） 連接超高效液相色譜 （ultra performance liquid chromatography，UPLC），通過高分辨率分析儀Orbitrap檢測并獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。采用MaxQuan（tV.1.4.1.2） 搜索二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并在Swissprot-Mouse數(shù)據(jù)庫 （https：//www.uniprot.org/statistics/Swiss-Prot）進行數(shù)據(jù)匹配，同時使用反數(shù)據(jù)庫排除隨機匹配引起的誤報。（1）消化酶設(shè)置為Trypin/P；（2）最小肽段長度設(shè)置為7個氨基酸殘基；（3）最高耐受4個漏切位點、5種修飾和5個電荷；（4）進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制。

1.4 蛋白質(zhì)基因本體 （gene ontology，GO） 注釋和亞細胞定位

使用UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫 （www.http：//www.ebi.ac.uk/GOA/） 對蛋白質(zhì)進行GO注釋。InterProScan軟件用于功能性GO注釋。根據(jù)GO注釋將差異表達的蛋白質(zhì)分為生物過程、細胞成分和分子功能3類進行分析。Wolfpsort軟件用于蛋白質(zhì)的亞細胞定位。

1.5 真核直系同源組 （clusters of eukaryotic orthologous groups，KOG） 分析

利用KOG數(shù)據(jù)庫 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/KOG） 將差異表達的蛋白分為信息存儲和處理、細胞過程和信號傳導(dǎo)、新陳代謝以及欠佳表征4類進行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GO富集分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopeida of genes and genomes，KEGG） 富集分析 （KEGG數(shù)據(jù)庫，http：// www.genome.jp/kegg）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域富集分析 （InterPro數(shù)據(jù)庫，http：//www.ebi.ac.uk/interpro/） 和復(fù)合物富集分析 （CORUM數(shù)據(jù)庫，http：//mips.gsf.de/genre/proj/corum/index.html），分別檢測差異表達蛋白在功能、通路、結(jié)構(gòu)域、復(fù)合物中的比例及變化情況，采用Fisher確切概率法 （雙側(cè)）得到富集檢驗的P值，然后對數(shù)轉(zhuǎn)換作為橫坐標，富集分析的條形圖越長，代表差異表達蛋白在該分類或者功能上的富集越顯著。使用標準錯誤發(fā)現(xiàn)率控制方法對多種假設(shè)檢驗進行校正，校正后P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠晶狀體上皮細胞乙酰化頻率和位點性質(zhì)分析

共鑒定出694個乙?；鞍?，蛋白發(fā)生乙?；奈稽c1～19個。共有224個 （32%） 蛋白具有多個賴氨酸乙酰化修飾位點，其中，Nucleolin （P09405）和Filamin-B （Q80X90） 有9個乙?；稽c；Histone H2B type1-C/E/G （Q6ZWY9） 有10個乙?；稽c；Myosin-9 （Q8VDD5） 有19個乙?；稽c。另外，得分>40的1 147個乙?；亩味繖z測結(jié)果顯示，肽段因長度不同表現(xiàn)出不同的豐度，多數(shù)肽段長度為8～14個氨基酸，與胰蛋白酶肽段的特性一致。質(zhì)量誤差設(shè)置為10/百萬，質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)控檢驗結(jié)果顯示質(zhì)譜儀處于性能穩(wěn)定狀態(tài)時，得到的肽段誤差呈正態(tài)分布。

2.2 高糖環(huán)境下小鼠晶狀體上皮細胞中乙?；腉O分析和亞細胞定位

結(jié)果顯示，19%表達上調(diào)和23%表達下調(diào)的乙酰化蛋白在生物過程中參與了細胞過程；16%表達上調(diào)和21%表達下調(diào)的乙酰化蛋白參與了代謝過程。52%表達上調(diào)和48%表達下調(diào)的乙?；鞍拙哂薪Y(jié)合功能；28%表達上調(diào)和37%表達下調(diào)的乙?；鞍拙哂写呋钚?。32%表達上調(diào)和32%表達下調(diào)的乙酰化蛋白發(fā)生在細胞中；27%表達上調(diào)和31%表達下調(diào)的乙酰化蛋白發(fā)生在細胞器。乙酰化蛋白的亞細胞定位結(jié)果顯示，45%表達上調(diào)的乙?；鞍孜挥诩毎?；44%表達下調(diào)的乙?；鞍孜挥诰€粒體。40%表達上調(diào)的乙酰化蛋白位于細胞質(zhì)中，28%表達下調(diào)的乙?；鞍追植荚诩毎酥?，見表1。表明高糖微環(huán)境下晶狀體上皮細胞內(nèi)乙酰化蛋白發(fā)生了廣泛的生物學(xué)變化。

2.3 高糖環(huán)境下小鼠晶狀體上皮細胞中乙?；腒OG分析

表1 高糖環(huán)境下小鼠晶狀體上皮細胞中乙?；腉O分析和亞細胞定位Tab.1 GO analysis and subcellular localization of acetylation in mouse lens epithelial cells under the high-glucose conditions

將72個表達顯著上調(diào)的蛋白分為19個類別 （圖1A） 。根據(jù)KOG注釋，物質(zhì)代謝類別 （KOG類別G、F、I和P） 和能量代謝類別 （KOG類別C） 蛋白發(fā)生了顯著乙?；Ｈ旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)更新、分子伴侶 （分別為KOG分類B、J和O） 有關(guān)蛋白也被乙?；?。將55個表達顯著下調(diào)的蛋白分為16個類別 （圖1B） 。根據(jù)KOG注釋，物質(zhì)代謝類別 （KOG類別G、E、F、H、I和P） 和能量代謝類別 （KOG類別C） 蛋白是主要鑒定的乙?；鞍?。翻譯后修飾、蛋白質(zhì)更新、分子伴侶，RNA加工和修飾和轉(zhuǎn)錄 （分別為KOG類別O、A和K）相關(guān)蛋白也被乙?；揎棥?/p>

2.4 高糖環(huán)境下小鼠晶狀體上皮細胞中乙?；墓δ芨患?/h3>

圖1 高糖環(huán)境下小鼠晶狀體上皮細胞中乙酰化的KOG分析Fig.1 KOG of acetylation in mouse lens epithelial cells under the high-glucose conditions

生物過程、細胞成分和分子功能的富集程度結(jié)果顯示： （1） 生物過程，氧化還原過程、前體代謝產(chǎn)物和能量產(chǎn)生、免疫受體的體細胞多樣化、體細胞DNA重組、二羧酸代謝過程和B細胞有關(guān)過程中均乙酰化蛋白富集水平顯著。（2） 細胞成分，乙酰化蛋白主要富集在線粒體、核小體、DNA彎曲復(fù)合體、線粒體部分、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體、細胞表面、剪接體復(fù)合體和線粒體基質(zhì)中。（3） 分子功能，蛋白質(zhì)異二聚活性、DNA結(jié)合、氧化還原酶活性、脂肪酰基-CoA結(jié)合、分子內(nèi)氧化還原酶活性不匹配的DNA結(jié)合相關(guān)的功能中存在顯著富集。見圖2。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，乙酰化蛋白主要富集全身性紅斑狼瘡，酒精中毒，甲狀腺激素合成，碳代謝，剪接體，麻疹，RNA降解，過氧化物酶、果糖、甘露醇代謝等生理病理過程，見圖3。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域富集分析結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域富集在組蛋白折疊、組蛋白核心、烯醇酶、富含GC的序列DNA結(jié)合、共激活因子CBP、KIX域、鋅指、SWAP、plectin/S10、核受體共激活因子和醛縮酶類型TIM，見圖4。乙?；鞍讖?fù)合物顯著富集在muts-α-組蛋白H4復(fù)合物、TRPV5-S100A10-annexin 2復(fù)合物和S100A10-annexin 2復(fù)合物，見圖5。

圖2 高糖環(huán)境下小鼠晶狀體上皮細胞中乙?；腉O功能富集Fig.2 GO functional enrichment of acetylation in mouse lens epithelial cells under the high-glucose conditions

3 討論

本研究在小鼠晶狀體上皮細胞中共鑒定出694個乙?；鞍祝鞍装l(fā)生乙?；奈稽c1～19個。多數(shù)鑒定出的蛋白僅有1個或2個位點乙酰化，少數(shù)蛋白具有多個乙酰化位點。其中Myosin-9 （Q8VDD5） 具有19個乙酰化位點，該蛋白涉及多個重要功能 （胞質(zhì)分裂、細胞運動和細胞形態(tài)維持等） 。已有研究［21］顯示GroEL2是迄今為止報道的具有最多 （24個） 賴氨酸乙?；稽c的蛋白。一些蛋白質(zhì)為何具有多個乙酰化位點，不同的乙?；稽c是同時還是逐步發(fā)生乙?；瘑栴}仍有待深入研究。為了評估小鼠晶狀體上皮細胞中乙?；稽c的分布特點，本研究計算了每個乙酰化蛋白的修飾位點數(shù)量。結(jié)果顯示，共有224個 （32%） 蛋白具有多個賴氨酸乙酰化修飾位點。有研究［22］報道結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)202個（26.2%） 蛋白乙?；?，與枯草芽孢桿菌51個（18.8%）蛋白乙?；容^，提示賴氨酸乙?；诮Y(jié)核分枝桿菌中具有重要生理作用。由此推論，乙酰化在小鼠晶狀體上皮細胞內(nèi)也具有重要作用。

為了全面了解高糖對α-TN4細胞中蛋白賴氨酸乙酰化的影響，對所有已鑒定的乙酰化蛋白的GO功能分類、亞細胞定位和KOG功能分類進行分析。KOG可對真核細胞蛋白進行完整全面的分類，與GO和KEGG比較，KOG數(shù)據(jù)庫提供的蛋白類別更多［23］。KOG分析結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境中晶狀體上皮細胞內(nèi)乙酰化主要參與了代謝過程，這與家蠶［23］、玫瑰孢菌［24］、大腸桿菌［25］和副溶血弧菌［26］等相關(guān)研究闡述乙酰化廣泛存在于各物種的代謝過程一致。本研究結(jié)果表明晶狀體上皮細胞內(nèi)乙?；诖x過程中起主要作用，KOG分類也顯示乙酰化廣泛影響其他生物學(xué)功能。對乙酰化的生物學(xué)功能分析結(jié)果顯示，乙?；哂袕V泛的分子功能，并且參與了晶狀體上皮細胞內(nèi)的眾多生物過程。這種廣泛的功能對調(diào)節(jié)晶狀體上皮細胞的內(nèi)部環(huán)境和影響晶狀體透明性等方面都起著重要作用，進而影響糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。

圖3 高糖環(huán)境下小鼠晶狀體上皮細胞中乙?；腒EGG功能富集Fig.3 KEGG functional enrichment of acetylation in mouse lens epithelial cells under the high-glucose conditions

圖4 高糖環(huán)境下小鼠晶狀體上皮細胞中乙?；牡鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)域功能富集Fig.4 Domain functional enrichment of acetylation in mouse lens epithelial cells under the high-glucose conditions

圖5 高糖環(huán)境下小鼠晶狀體上皮細胞中乙?；牡鞍踪|(zhì)復(fù)合物功能富集Fig.5 Complex functional enrichment of acetylation in mouse lens epithelial cells under the high-glucose conditions

綜上所述，本研究使用SILAC標記和泛乙酰化富集進行了高分辨率LC-MS/MS和生物信息學(xué)分析，成功揭示了高糖處理后晶狀體上皮細胞中賴氨酸乙?；娜孀兓１狙芯繛槭状卧讦?TN4細胞中進行高糖條件下的賴氨酸乙?；偷鞍踪|(zhì)組學(xué)分析。高糖誘導(dǎo)的賴氨酸乙酰化通過參與和改變多種生物功能、通路、結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)復(fù)合物，進而改變眾多蛋白的表達及其功能。本研究為闡明小鼠晶狀體上皮細胞中高糖微環(huán)境下致病機制，探索糖尿病性白內(nèi)障治療靶點提供了重要依據(jù)。