膽維丁乳對(duì)急性肺損傷小鼠肺表面活性物質(zhì)的影響

李野，李斌超，張雅琳，劉寧，劉祖望，孔娟

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，沈陽 110004）

急性肺損傷 （acute lung injury，ALI） 是肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的急性肺部炎癥綜合征 （acute respiratory distress syndrome，ARDS）［1］，是一種高死亡率的急危重癥。通過氣管滴注脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）可建立ALI 小鼠模型［2］。

肺表面活性物質(zhì)由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌，主要成分為二棕櫚酰卵磷脂和肺表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白 （surfactant protein，SP），分布于肺泡液體分子層表面，能降低肺泡表面張力，維持大小肺泡容量的相對(duì)穩(wěn)定［3］，阻止肺泡毛細(xì)血管中液體向肺泡內(nèi)濾出，是治療ALI的有效手段［4］。目前已知的SP有SP-A、SP-B、SP-C、SP-D 4種。維生素D是一種脂溶性類固醇激素，在鈣磷平衡和骨代謝中起重要作用［5-7］，并可通過其受體 （vitamin D receptor，VDR） 調(diào)控多種生理反應(yīng)［2，8-16］。研究［17-19］發(fā)現(xiàn)，維生素D3能調(diào)節(jié)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖。膽維丁乳 （cholecalciterol cholesterol emulsion，CCE） 是一種新型的活性維生素D前體，臨床上常用于治療嬰幼兒維生素D缺乏性佝僂病。SP在維生素D缺乏小鼠的肺中表達(dá)減少［20］。本研究擬探討CCE對(duì)LPS所致ALI肺表面活性物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 制作動(dòng)物模型與分組

將36只健康雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、CCE組、LPS組、LPS+CCE組，每組9只。正常對(duì)照組和LPS組給予飲用水，CCE組和LPS+CCE組小鼠給予10%CCE水溶液 （避光，購自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院）。飼喂14 d后，LPS 組和LPS+CCE組小鼠行氣管切開，滴注LPS （10 mg/kg），24 h后取血清、肺泡灌洗液及肺組織備用。

1.2 檢測血清鈣、磷的含量

從小鼠心臟取血，分離血清，采用鈣測試盒 （帶標(biāo)準(zhǔn)） 微板法 （C004-2，南京建成生物工程研究所）、無機(jī)磷測試盒 （C006-1，南京建成生物工程研究所）檢測各組小鼠血清鈣、磷含量。

1.3 測定小鼠肺組織濕/干質(zhì)量比

取4組小鼠的右下肺，用吸水紙吸干肺組織表面血跡，立即稱質(zhì)量，記為“濕質(zhì)量”。置于80 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，48 h后稱質(zhì)量，記為“干質(zhì)量”。計(jì)算肺濕/干質(zhì)量比。

1.4 肺組織HE染色

4%多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋并切片，脫蠟，HE染色，封片，光鏡下觀察并拍照。

1.5 實(shí)時(shí)PCR

用TRIzol試劑盒 （美國Invitrogen公司） 提取肺組織總RNA，按照產(chǎn)品說明書操作。用生物分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度。取2 μg RNA樣本，用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （A2302-1，日本TaKaRa公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)條件按照試劑盒說明書設(shè)置。引物由上海生工生物工程公司合成，見表1。

1.6 Western blotting

取肺組織，研磨勻漿后，蛋白裂解，BCA法檢測總蛋白濃度。取50 μg總蛋白，行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗（VDR抗體 1：1 000稀釋，購自美國SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司；GAPDH抗體 1 ∶5 000稀釋，購自美國Proteintech公司），4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，室溫孵育二抗1 h，ECL顯色。Image J圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析比較。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.7 繪制生存曲線

另取健康雄性BALB/c小鼠20只，分為LPS組、LPS+CCE組，每組10只，處置同1.1，繪制并分析2組小鼠生存時(shí)間曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量結(jié)果均采用表示，采用方差分析或配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCE對(duì)ALI模型小鼠血清鈣、磷含量的影響

如表2所示，喂飼CCE 2周后，4組小鼠血清鈣、磷水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明CCE對(duì)LPS所致ALI模型小鼠血清鈣、磷的影響較小，故可排除血清鈣、磷水平的高低對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

2.2 CCE對(duì)ALI模型小鼠生存時(shí)間的影響

如圖1所示，LPS+CCE組小鼠平均生存時(shí)間長于LPS組，小鼠死亡的首發(fā)時(shí)間晚于LPS組，給予LPS處理后25 h，LPS+CCE組小鼠仍有80%存活，LPS組則有40%小鼠死亡；53 h以內(nèi)LPS組小鼠全部死亡，2組小鼠生存時(shí)間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P< 0.05）。表明CCE能顯著延長ALI小鼠的生存時(shí)間，對(duì)ALI起保護(hù)作用。

2.3 CCE對(duì)ALI模型小鼠肺組織及肺水腫的影響

肉眼觀察可見，與正常對(duì)照組相比，LPS組小鼠雙肺腫脹，體積變大，肺表面可見出血區(qū)。光鏡下（圖2A） 可見，正常對(duì)照組與CCE組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔和間隙內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤；LPS組小鼠肺泡和肺間質(zhì)廣泛充血、水腫、大量炎性滲出液，肺泡腔可見破裂的紅細(xì)胞和滲出物，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔狹窄，肺泡間隔增厚；與LPS組相比，LPS+CCE組小鼠肺泡和肺間質(zhì)微血管充血擴(kuò)張程度及炎癥細(xì)胞浸潤減輕，肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞減少。

表2 4組小鼠血清鈣、磷含量 （，n=9）Tab.2 Serum calcium and phosphorus contents in 4 groups （，n=9）

表2 4組小鼠血清鈣、磷含量 （，n=9）Tab.2 Serum calcium and phosphorus contents in 4 groups （，n=9）

CCE，cholecalciterol cholesterol emulsion；LPS，lipopolysaccharides.

圖1 Kaplan-Meier法測定LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠生存曲線 （n=10）Fig.1 The survival curve of ALI mice induced by LPS determined by Kaplan-Meier method （n=10）

為了觀察ALI時(shí)肺泡和肺間質(zhì)充血、水腫的程度，本研究進(jìn)一步檢測了肺濕/干質(zhì)量比。結(jié)果如圖2B所示，LPS組小鼠肺濕/干質(zhì)量高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P< 0.01）；LPS+CCE組較LPS組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.023）。提示CCE能改善ALI肺組織水腫程度。

2.4 CCE對(duì)ALI模型小鼠肺中VDR表達(dá)的影響

圖2 CCE對(duì)ALI小鼠肺組織病理變化及水腫程度的影響Fig.2 The effect of CCE on the pathological changes of lung tissue and the degree of edema in ALI mice

Western blotting和實(shí)時(shí)PCR結(jié)果如圖3所示，CCE 組小鼠肺組織中VDR蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，LPS+CCE組VDR蛋白表達(dá)水平高于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.012，P=0.005）。提示飼喂CCE能增加小鼠肺組織內(nèi)VDR表達(dá)。

2.5 CCE對(duì)ALI模型小鼠肺組織SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA表達(dá)的影響

如表3所示，CCE小鼠肺組織SP-A、SP-C和SP-D的表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007，P=0.011，P=0.006）；與正常對(duì)照組相比，LPS組SP-A、SP-B、SP-C、SP-D的表達(dá)水平均顯著下降 （P=0.006，P=0.016，P=0.001，P=0.001），而LPS+CCE組SP-A、SP-B、SP-C、SP-D的表達(dá)水平均較LPS組顯著上升 （P=0.001，P=0.049，P=0.001，P=0.042），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明CCE能促進(jìn)小鼠肺泡中肺表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

3 討論

盡管臨床研究［21-22］發(fā)現(xiàn)，活性維生素D可影響血清鈣磷水平，但本研究結(jié)果顯示CCE并未影響小鼠的血清鈣磷水平，因此排除了血清鈣磷對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

圖3 小鼠肺組織VDR蛋白及mRNA表達(dá)情況Fig.3 Expression of VDR protein and mRNA in the lungs of mice

表3 各組小鼠肺中SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA表達(dá)水平比較 （n=9）Tab.3 Comparison of the mRNA expression levels of SP-A，SP-B，SP-C and SP-D in the lungs of mice in each group （n=9）

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS+CCE組小鼠死亡首發(fā)時(shí)間晚于LPS組，且平均生存時(shí)間長于LPS組，提示維生素D前體CCE有顯著延長ALI小鼠生存時(shí)間的作用，原因可能與維生素D的抗炎特性有關(guān)［23-24］。本研究還發(fā)現(xiàn)，CCE具有減輕ALI所致肺組織損傷的作用。HE染色顯示，LPS組小鼠肺組織可見肺泡上皮細(xì)胞及間質(zhì)水腫、肺泡腔內(nèi)滲出、充血、炎癥細(xì)胞浸潤等典型ALI病理改變［25］，而LPS+CCE組ALI病理改變較LPS組減輕。小鼠肺濕/干質(zhì)量比能反映ALI所致肺水腫的程度，ALI時(shí)肺水腫嚴(yán)重，肺濕/干質(zhì)量比升高［26］。本研究結(jié)果顯示，LPS+CCE組肺濕/干質(zhì)量比較LPS組降低，提示CCE在一定程度上緩解了LPS對(duì)小鼠造成的ALI肺水腫。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組和LPS組相比，CCE組和LPS+CCE組小鼠肺組織內(nèi)VDR表達(dá)水平顯著升高，表明飼喂CCE能使小鼠體內(nèi)VDR表達(dá)增多。研究［27-29］表明，ALI會(huì)造成肺泡不穩(wěn)定、肺泡去復(fù)張及相應(yīng)的組織重塑，肺表面活性物質(zhì)可降低肺泡表面張力，從而防止低肺容量時(shí)發(fā)生肺泡塌陷及水腫［30-31］，因此增加肺表面活性物質(zhì)可治療ALI［4］。維生素D3可加速胎兒肺成熟和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分化，并增加大鼠肺組織和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中肺表面活性物質(zhì)的表達(dá)和分泌［32-34］。有研究［35］表明，維生素D3可直接作用于原代培養(yǎng)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)SP-BmRNA的產(chǎn)生，故推測維生素D前體CCE對(duì)ALI的保護(hù)作用有可能是因?yàn)樵黾恿朔伪砻婊钚晕镔|(zhì)，因此本研究檢測了各組小鼠肺組織中SP-A、SP-B、SP-C、SP-D的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)CCE確能增加SP的表達(dá)。

綜上所述，本研究證實(shí)了維生素D前體物質(zhì)CCE能緩解LPS造成的ALI，改善并延長ALI小鼠的生存時(shí)間，改善肺組織病理學(xué)變化及肺水腫，增加SP的表達(dá)。因此，維生素D前體CCE增加肺表面活性物質(zhì)可能是緩解ALI的機(jī)制之一，為探索ALI治療方法提供了新的思路。