5-羥基-1-甲基海因?qū)Π俨菘葜卸舅路螕p傷保護(hù)作用的代謝組學(xué)研究

高利娜，王光，袁慧雅，劉俊亭

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)毒物分析教研室；2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，沈陽 110122）

5-羥基-1-甲基海因 （5-hydroxy-1-methylhydantoin，HMH） 是內(nèi)源性的抗氧化劑［1-2］，能夠清除羥基自由基，抑制慢性腎臟疾病的進(jìn)展，對(duì)高糖和緩激肽刺激的血管提供保護(hù)，改善血管損傷和重構(gòu)［3-5］。百草枯 （paraquat，PQ） 是廣泛應(yīng)用的非選擇性廣譜除草劑，具有極強(qiáng)的毒性，口服中毒致死率為60%～80%［6-7］。PQ的中毒機(jī)制不清，多認(rèn)為其肺損傷機(jī)制主要是線粒體功能障礙及氧自由基損傷［8］。前期研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，HMH可通過其抗氧化特性保護(hù)PQ所致腎損傷。PQ中毒的靶器官是肺臟，中毒后可出現(xiàn)呼吸窘迫，中毒者多死于急性肺損傷及中毒后進(jìn)行性肺纖維化。本研究擬通過檢測超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 含量、血紅素氧合酶1 （heme oxygenase-1，HO-1） 及代謝產(chǎn)物，探討HMH對(duì)PQ中毒模型小鼠肺組織的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：HMH （上海一研生物技術(shù)有限公司），PQ （麥克林上海生物有限公司），SOD活性檢測試劑盒 （碧云天生物試劑有限公司），MDA檢測試劑盒 （貝博生物試劑有限公司），山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、小鼠抗β-actin單克隆抗體 （中杉金橋生物科技公司），ECL發(fā)光液、BCA蛋白定量試劑盒、HO-1兔多克隆抗體 （武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備：SPF級(jí)4周齡雄性昆明小鼠30只，體質(zhì)量 （30±2） g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK （遼）2018-0008。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為生理鹽水（NS） 組、PQ組、HMH組，每組10只。采用PQ一次性灌胃 （20 mg/kg） 制備PQ中毒動(dòng)物模型；NS組灌胃等量生理鹽水；HMH組于造模后每天同一時(shí)間腹腔注射HMH （100 mg/kg），連續(xù)5 d。于第6天處死全部小鼠，留取肺組織備檢。本研究中動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，獲得中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審批 （審批號(hào)2018072）。

1.2 方法

1.2.1 肺組織形態(tài)學(xué)觀察：4%多聚甲醛固定肺組織48 h，脫水、浸蠟、包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.2 肺組織MDA含量及SOD活性測定：冰浴狀態(tài)下剖取肺組織，搗碎勻漿，按照試劑盒說明書操作檢測肺組織中MDA含量及SOD活性。

1.2.3 Western blotting檢測肺組織中HO-1蛋白表達(dá)：提取肺組織胞質(zhì)蛋白20 μg，煮沸5 min變性，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用TBST洗滌3次，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；加入一抗 （1︰1 000），4℃搖床過夜，洗滌3次，加入二抗 （1︰3 000） 室溫孵育2 h，洗滌3次后，采用化學(xué)發(fā)光試劑檢測，圖像分析系統(tǒng)定量分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測肺組織代謝產(chǎn)物：取0.1 mg肺組織 （液氮研磨） 置于EP管中，加入80%甲醇水溶液400 μL （4倍體積甲醇），渦旋震蕩，置-20℃靜置60 min，14 000g、4 ℃離心20 min，取上清液置于1.5 mL離心管中，真空冷凍干燥，將殘留物溶于100 μL復(fù)溶劑，渦旋振蕩，14 000g、4 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)行LC-MS分析。色譜條件：色譜柱Accucore HILIC column，柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min。正模式：流動(dòng)相A （0.1%甲酸，95%乙腈，10 mmol/L醋酸銨），流動(dòng)相B （0.1%甲酸，50%乙腈，10 mmol/L醋酸銨）。負(fù)模式：流動(dòng)相A （95%乙腈，10 mmol/L醋酸銨，pH9），流動(dòng)相B （50%乙腈，10 mmol/L 醋酸銨，pH9）。色譜梯度洗脫程序：0～1 min，A%︰B%=98︰2；17～17.5 min，A%︰B%=50︰50；18～20 min，A%︰B%=98︰2。質(zhì)譜條件：掃描范圍選擇m/z 100～1 500；ESI源設(shè)置為噴霧電壓3.2 kV；鞘氣流速35 arb；尾氣流速10 arb；毛細(xì)管溫度320 ℃。正負(fù)模式下掃描。MS/MS掃描為數(shù)據(jù)依賴性全掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理改變

光鏡下可見，NS組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺血管規(guī)則，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤 （圖1A）。PQ組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)明顯增加，肺泡內(nèi)可見水腫液，肺血管內(nèi)皮腫脹、出血，可見炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡腔形成透明膜 （圖1B）；HMH組肺泡水腫及炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，少量炎性滲出及出血 （圖1C）。

圖1 光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理改變 HE ×200Fig.1 Pathological changes of lung tissues in each group were observed under light microscope HE ×200

2.2 各組肺組織SOD活性及MDA含量

與NS組比較，PQ組和HMH組肺組織MDA含量均顯著升高 （均P< 0.001），SOD活性均顯著下降 （均P< 0.001）；且HMH組MDA含量低于PQ組，SOD活性高于PQ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P< 0.001）。見表1。

2.3 各組肺組織HO-1蛋白表達(dá)變化

與NS組比較，PQ組和HMH組肺組織HO-1表達(dá)水平均增高，且PQ組表達(dá)水平高于HMH組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P< 0.001）。見圖2。

2.4 代謝組學(xué)分析結(jié)果

2.4.1 差異代謝產(chǎn)物火山圖：在質(zhì)譜儀的正負(fù)離子模式下觀察代謝產(chǎn)物的變化情況，如圖3所示，在質(zhì)譜儀的正模式下，篩選出87個(gè)具有顯著性差異的代謝物；在質(zhì)譜儀的負(fù)離子模式下，篩選出59個(gè)顯著性差異代謝物 （P< 0.05，VIP> 1）。

表1 各組肺組織SOD活性、MDA和HO-1蛋白含量比較Tab.1 Comparison of SOD activity，MDA content and HO-1 protein in lung tissues of each group

圖2 Western blotting檢測各組小鼠肺組織HO-1蛋白表達(dá)Fig.2 HO-1 protein expression in lung tissues of mice in each group was detected by Western blotting

2.4.2 PCA和PLS-DA：為了得到有意義的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，進(jìn)行了PCA及PLS-PCA。結(jié)果如圖4、5所示，HMH組和PQ組均在95%置信區(qū)間里得到很好的分離。

2.4.3 差異代謝產(chǎn)物：如表2所示，HMH組和PQ組間的差異代謝產(chǎn)物代謝通路主要集中于檸檬酸循環(huán)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、牛磺酸和亞?；撬岽x、微生物代謝、脂肪細(xì)胞脂解調(diào)控、嘌呤嘧啶代謝。

3 討論

圖3 差異代謝物火山圖Fig.3 The volcano map of different metabolites

圖4 主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis diagram

肺臟是PQ中毒主要的靶器官，經(jīng)肺臟攝取PQ后發(fā)生氧化還原反應(yīng)，干擾線粒體電子傳遞，產(chǎn)生大量氧自由基，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷［9］。PQ進(jìn)入體內(nèi)后以原型形式經(jīng)腎排泄，在腎臟濃度最高，導(dǎo)致腎臟功能受損，使PQ不能被正常排泄，在體內(nèi)進(jìn)一步蓄積，從而累及肝、心、肺等其他器官，導(dǎo)致多器官功能衰竭［11-12］。

圖5 偏最小二乘法-判別分析圖Fig.5 Partial least squares-discriminant analysis diagram

表2 HMH組和PQ組間的差異代謝產(chǎn)物Tab.2 The differential expression metabolites between the HMH group and the PQ group

肌酐是肌酸以恒定速率產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，在腎功能受損時(shí)，肌酐大量蓄積后代謝產(chǎn)生HMH。HMH是一種抗氧化劑，能消除羥基自由基［1-2］。本研究發(fā)現(xiàn)，PQ中毒模型小鼠肺組織抗氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量顯著升高，而SOD活性顯著下降。與PQ組相比，HMH組MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，提示HMH對(duì)PQ中毒所致肺損傷有保護(hù)作用。

HO-1是一種應(yīng)激蛋白和內(nèi)源性保護(hù)因子，是細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分，在抗氧化應(yīng)激、抗炎等方面起著重要作用［13-14］。研究［13］發(fā)現(xiàn)，PQ中毒小鼠肺組織中HO-1蛋白表達(dá)升高。邱俏檬等［15］發(fā)現(xiàn)，血必凈注射液治療可提高硫化氫中毒大鼠肺組織HO-1蛋白活性，減輕肺損傷。本研究結(jié)果顯示，HO-1在PQ中毒小鼠肺組織中表達(dá)增加，而HMH組HO-1水平較PQ組顯著增高。因此，推測HMH通過激活HO-1蛋白表達(dá)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

天冬氨酸普遍存在于生物合成作用中，是生物體內(nèi)賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體。研究［16］顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)使N-乙酰天冬氨酸濃度降低。HMH組N-乙酰-L-天冬氨酸水平和谷氨酸含量較PQ組增高，猜測谷氨酸可能改善PQ中毒所致氧化損傷。與PQ組相比，HMH組嘧啶代謝相關(guān)產(chǎn)物增加，黃嘌呤含量降低，提示HMH能調(diào)節(jié)PQ導(dǎo)致的嘧啶嘌呤代謝紊亂；研究［17］顯示，5’-磷酸腺苷誘導(dǎo)低溫發(fā)揮抗炎功能，HMH組5’-磷酸腺苷水平升高，推測HMH能抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展。前列腺素是二十碳不飽和脂肪酸花生四烯酸經(jīng)酶促代謝產(chǎn)生的一類脂質(zhì)介質(zhì)，HMH組的前列腺素G水平較PQ組下降，提示中毒模型小鼠肺組織炎癥減輕。吡哆酸是維生素B6的代謝產(chǎn)物，維生素B6是抗氧化物質(zhì)［18］，HMH組吡哆酸低于PQ組，推測維生素B6與過氧化物發(fā)生反應(yīng)，從而防護(hù)PQ造成的氧化損傷。亞?；撬嵩隗w內(nèi)可與過氧化物反應(yīng)生成牛磺酸，次?；撬崾呛芎玫目寡趸镔|(zhì)［19-20］。HMH組亞?；撬岷扛哂赑Q組，猜測HMH能防護(hù)PQ引發(fā)的氧化自由基損傷。皮質(zhì)甾酮參與細(xì)胞脂質(zhì)氧化代謝和醛固酮合成與分泌，HMH組皮質(zhì)甾酮含量下降，說明脂質(zhì)過氧化水平減弱，醛固酮水平降低，這與研究［5］報(bào)道的HMH能夠平緩血管平滑肌作用一致。硫代苯甲酰胺二硫化物是氨基苯甲酸的降解產(chǎn)物，與磷酸乙酸共同參與微生物代謝，故推測HMH組可能通過影響微生物代謝，從而對(duì)機(jī)體代謝產(chǎn)生影響，改善PQ導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

總之，HMH能顯著降低PQ中毒模型小鼠肺組織MDA水平，增加SOD活性及HO-1蛋白表達(dá)，糾正PQ導(dǎo)致的TCA循環(huán)、嘧啶嘌呤類物質(zhì)代謝、氨基酸代謝紊亂和脂質(zhì)過氧化損傷，減輕PQ所致炎癥反應(yīng)。因此，HMH可作為防護(hù)PQ中毒損傷的替代治療藥物。