凱氏定氮法測定豆類粗蛋白含量的消解條件探究

顏常盛

（核工業(yè)二七〇研究所，南昌330200）

已報道的蛋白質(zhì)測定方法很多， 如凱氏定氮法、 雙縮脲法、 酚試劑法和紫外吸收法等［1-5］，主要可分為間接法和直接法兩類，較為經(jīng)典的間接法為凱氏定氮法。 利用凱氏定氮法測量蛋白質(zhì)含量時， 催化劑和濃硫酸使蛋白質(zhì)中的碳?xì)浠衔锉谎趸?生成二氧化碳和水而逸出， 氮元素則轉(zhuǎn)化為氨根， 與硫酸根結(jié)合形成硫酸銨，存于消解液當(dāng)中［6-7］。在強(qiáng)堿環(huán)境中， 對消解液進(jìn)行蒸汽加熱， 使硫酸銨分解， 生成的氨氣隨水蒸氣蒸餾出來被過量的硼酸液吸收， 最后用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定， 測定試樣中的氮含量，通過系數(shù)折算出蛋白質(zhì)含量。

豆類是一類高蛋白、 高脂肪、 高碳水化合物的農(nóng)作物， 主要可分為兩大類： 粗蛋白含量較高的豆類， 如黃豆和黑豆； 碳水化合物含量較高的豆類，如紅豆、赤豆和綠豆等。目前對于豆類粗蛋白含量的分析， 僅停留在對大豆和大豆制品的蛋白含量研究層面， 而對于其他豆類粗蛋白的分析測定基本上為空白。 全自動凱氏定氮儀的興起， 使各類領(lǐng)域內(nèi)的分析人員， 在如何精準(zhǔn)、 快速測定物質(zhì)蛋白質(zhì)含量的技術(shù)上做各種條件優(yōu)化試驗，為大批量、 高效率地測定蛋白含量， 提供了有力的技術(shù)指導(dǎo)［8-9］。

本試驗以大豆、 黑豆、 赤豆和綠豆4 種常見的豆類為例， 利用全自動凱氏定氮儀較為全面地分析影響豆類粗蛋白含量測定的因素。 以樣品質(zhì)量、 硫酸添加量、 消化溫度和消解時間為試驗變量， 通過單一變量試驗和正交試驗， 建立不同種類豆類粗蛋白的最優(yōu)分析試驗?zāi)Ｐ停?為豆類蛋白質(zhì)的測定， 提供既高效又精準(zhǔn)的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

HF1×100 g 型全密封制樣粉碎機(jī)， 購置于浙江豐利公司；BSA224A-CW 型萬分之一天平，購置于賽多利斯公司；K1100 型全自動凱氏定氮儀、SH220F 型石墨消解爐購置于海能儀器廠。

1.2 材料與試劑

本實驗選用粗蛋白含量跨度較大的4 種常見的豆類農(nóng)作物， 包括大豆、 黑豆、 赤豆和綠豆。濃硫酸（1.84 g·mL-1）、氫氧化鈉溶液（400 g·L-1）、硼酸吸收液 （20 g·L-1）、硼砂標(biāo)準(zhǔn)滴定液 （0.039 8 mol·L-1）、 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.105 4 mol·L-1）、甲基紅乙醇溶液（0.1%）和溴甲酚綠的乙醇溶液 （0.1%）， 定氮催化片（K2SO4∶CuSO4＝3.6∶0.4）、 石蠟油和硫酸銨，以上實驗所用試劑純度均為分析純， 實驗用水均為去氨蒸餾水。

2 實驗方法

樣品的制備：取4 種豆籽各200 g，進(jìn)行洗滌、 晾干后， 經(jīng)粉碎機(jī)粉粹， 過篩80 目，置于磨口瓶中備用。

樣品的消解： 稱取適量的4 種豆籽粉碎樣， 置于消化管中， 加入一粒催化片、 適量體積的濃硫酸， 將消化管置于多孔石墨消解儀上對豆粉進(jìn)行消解。

樣品的蒸餾： 啟動全自動凱氏定氮儀，待儀器調(diào)整至穩(wěn)定狀態(tài)時， 將消化管固定在定氮儀上， 并在界面窗口上輸入具體分析參數(shù)（硼酸：25 mL，稀釋水30 mL， 加堿量：40 mL， 蛋白系數(shù)：6.25， 蒸汽流量：100%，蒸餾時間5 min， 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液溶度：0.105 4 mol·L-1）。

3 結(jié)果與討論

3.1 稱樣量對實驗結(jié)果的影響

目前， 國家標(biāo)準(zhǔn)只給整個豆類品種的大概稱樣量（0.2～2.0 g），對于粒徑尺寸均一的樣品， 適當(dāng)?shù)卦黾臃Q樣量， 能夠一定程度地降低系統(tǒng)誤差，但耗時長，消耗的硫酸量大。而減少稱樣量時， 消解時間縮短， 但又難于保證結(jié)果的精確度和準(zhǔn)確度。 為此確定特定某一種的豆類合理的稱樣量對分析結(jié)果具有十分重要的意義。

固定硫酸添加量為10.00 mL， 消解溫度為420 ℃，消解時間為90 min，催化劑1 片，考察4 種豆籽粉粹樣在不同質(zhì)量下， 消解后的粗蛋白質(zhì)含量結(jié)果，見圖1。

由圖1 可見，4 種豆類蛋白質(zhì)含量隨樣品稱樣量的變化出現(xiàn)了不同程度的變化， 不同種類的豆類其最佳稱樣量也有所不同（大豆：0.20 ～0.40 g， 黑 豆： 0.40 ～0.60 g， 綠 豆：0.40～0.70 g， 赤豆： 0.20～0.40 g）， 為此，在測定豆類蛋白含量時， 應(yīng)將稱樣量控制在0.30～0.60 g 之間，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

3.2 硫酸添加量對實驗結(jié)果的影響

圖1 樣品稱樣量對蛋白質(zhì)測量結(jié)果的影響Fig.1 Effect of sample weighting on protein measurement results

消解豆籽粉粹樣時，在催化劑的作用下，濃硫酸能夠破壞豆籽結(jié)構(gòu)中的蛋白大分子以及有機(jī)氮化物 （催化劑中的K2SO4與H2SO4形成的KHSO4提高溶液沸點(diǎn)，CuSO4用于判斷消解終點(diǎn)）， 使N 元素以游離的NH4SO4存在于消解液中。 過量地使用濃硫酸容易造成溫度過高， 使銨鹽分解， 分析結(jié)果偏低， 并且浪費(fèi)資源； 而減少濃硫酸的使用， 容易引起消解不完全， 使得分析結(jié)果不準(zhǔn)確， 為此，尋找最佳濃硫酸用量， 對確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和環(huán)境保護(hù)具有深刻意義。

固定稱樣量為0.4 g，消解溫度為420 ℃，消解時間為90 min， 催化劑1 片， 考察不同濃硫酸 添 加 量（2、4、6、8、10、12、14 和16 mL）對4 種豆籽粗蛋白測定的影響， 見圖2。

圖2 硫酸添加量對蛋白質(zhì)測量結(jié)果的影響Fig.2 Effect of concentrated sulfuric acid addition on protein measurement

由圖2 可知，由試驗結(jié)果可以看出，在4種豆籽樣品中， 硫酸添加量嚴(yán)重影響樣品的消解程度， 硫酸用量不足時， 樣品消解不完全， 體現(xiàn)在測得的粗蛋白含量低于正常值，硫酸添加過量時， 樣品消解過于徹底， 粗蛋白含量測得值出現(xiàn)不同程度的降低， 這是由于消解溫度過高，部分銨鹽發(fā)生了分解，引起蛋白含量的偏低， 用于消解大豆樣品的最佳硫酸添加量為6～10 mL， 黑豆為8～10 mL，赤豆為6～12 mL，綠豆為8～12 mL，不同的豆籽樣品有著不同的最佳硫酸添加范圍， 這是由4 種豆類種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異造成的。綜上所述，當(dāng)豆類粉碎樣在0.4 g 時，最佳硫酸用量為8～12 mL。

3.3 消解溫度對實驗結(jié)果的影響

在消解豆籽樣品時， 由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜， 石墨爐的消解溫度往往需要設(shè)置在400 ℃以上，而常用的消解酸中，以硫酸沸點(diǎn)最高為338 ℃（過氧化氫：105 ℃、硝酸：122 ℃、高氯酸：203 ℃）， 因此選擇硫酸作為消解酸液。 為了使樣品充分的消解和氮元素徹底的釋放， 研究人員通常采用程序升溫的來處理樣品。

參照程序升溫的步驟 （階段1：230 ℃保持20 min，階段2：350 ℃保持20 min，階段3：420 ℃保持90 min），在不改變階段1、階段2 的升溫過程及階段3 的保持時間（90 min）情況下，改變階段3 的保持溫度。固定樣品質(zhì)量0.40 g，10.00 mL 濃硫酸，1 片催化劑，考察不同的消解溫度（360、380、400、420、440、460和480 ℃）對粗蛋白質(zhì)含量的影響，見圖3。

圖3 消解溫度對蛋白質(zhì)測量結(jié)果的影響Fig.3 Effect of digestion temperature on protein measurement results

由圖3 可知，當(dāng)消解溫度低于400 ℃時，4 種豆籽樣品的蛋白含量隨溫度升高而升高，溫度在420～460 ℃區(qū)間時，4 種豆籽樣品的蛋白含量趨于穩(wěn)定，溫度高于460 ℃時，4 種豆籽樣品的蛋白含量出現(xiàn)不同程度的下降，為此，當(dāng)豆類粉碎樣在0.4 g， 硫酸用量為10 mL 時， 程序加熱3 階段的加熱溫度在420～460 ℃為最佳溫度區(qū)間。

3.4 消解時間對實驗結(jié)果的影響

消解時間是決定樣品是否完全消解的重要因素之一， 石墨消解儀在消解豆籽粉碎樣時， 國標(biāo)文件上推薦的時間為90 min， 而對于結(jié)構(gòu)簡單的豆籽品種， 時間也未必需要90 min， 必然會造成資源的浪費(fèi)， 形成的銨鹽，也因此會分解。反之，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的豆籽，國標(biāo)規(guī)定的時間又可能難于滿足消解要求，使分析結(jié)果偏小。 因此， 為了得到準(zhǔn)確的粗蛋白含量， 針對不同種類豆籽樣品， 探尋最佳的消解時間至關(guān)重要。 儀器廠家以程序升溫對樣品進(jìn)行消解。 參照程序升溫的步驟（階段1：230 ℃保持20 min，階段2：350 ℃保持20 min， 階段3： 430 ℃保持90 min），保持階段1 和階段2 的升溫步驟， 固定樣品稱樣量0.4 g， 硫酸添加量8 mL， 催化劑1片，考察階段3 中430 ℃的不同保持時間，對粗蛋白含量測定結(jié)果的影響。

圖4 消解時間對蛋白質(zhì)測量結(jié)果的影響Fig.4 Effect of digestion time on protein measurement results

由圖4 可知， 程序升溫階段3 的加熱時間控制對樣品的消解起著至關(guān)重要的作用，維持時間不足會導(dǎo)致樣品消解不徹底， 反之時間過長， 會使得銨鹽分解， 兩種情況都將使得最終測得的粗蛋白含量偏低。 不同種類的豆籽有著不同的最佳維持時間，綜合而言，在階段3 中430 ℃保持60～80 min 較為合理。

3.5 正交實驗

在單因素水平的基礎(chǔ)上， 以大豆中的粗蛋白含量為對象， 選擇樣品質(zhì)量、 硫酸添加量、 消解時間和消解溫度進(jìn)行4 因素4 水平的正交試驗， 進(jìn)一步優(yōu)化凱氏定氮測量蛋白質(zhì)含量的條件，交叉實驗結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 交叉實驗結(jié)果Table 1 Cross experiment results

表2 方差分析結(jié)果Table 2 Results of variance analysis

由表1～2 可知， 消解溫度的顯著性為0.006（P＜0.05）和消解時間的顯著性為0.013（P＜0.05）， 可見消解溫度和消解時間的控制對測定結(jié)果具有顯著影響， 而硫酸添加量的顯著性為0.078（0.05＜0.078＜0.10）， 說明硫酸的添加量對測定結(jié)果有一定的影響， 而樣品質(zhì)量的大小則對結(jié)果影響不明顯， 即影響大小為： 消解溫度＞消解時間＞硫酸添加量＞樣品質(zhì)量， 因此， 當(dāng)稱樣量為0.4 g 時，消解溫度為430 ℃， 消解時間為60 min， 硫酸添加量為10 mL 時， 消解效果最佳， 所測的粗蛋白含量最大。

4 結(jié)論

以樣品質(zhì)量、 硫酸的添加量、 消解溫度和消解時間為實驗變量， 針對性地建立了不同實驗條件、 不同種類豆類的粗蛋白測量實驗， 得出常見豆籽樣品的最佳處理條件。 在測定豆籽樣品粗蛋白含量時， 豆籽樣品的消解溫度和消解時間的影響最為顯著， 硫酸添加量次之， 樣品質(zhì)量最小， 影響力順序為：消解溫度＞消解時間＞硫酸添加量＞樣品質(zhì)量， 得出在測定常見豆類樣品中粗蛋白量含量時， 質(zhì)量應(yīng)控制在0.4～0.6 g 之間較為合適， 最佳的消解溫度為430 ℃， 消解時間為60 min，硫酸添加量為10 mL。較為合理的樣品前處理條件， 在減少了環(huán)境污染節(jié)約資源的同時， 顯著地提高了豆籽粗蛋白含量的準(zhǔn)確性與精確性， 為進(jìn)一步更為深入地探究豆類樣品的蛋白成分提供了有力的支撐。