白藜蘆醇對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞形成的破骨細(xì)胞數(shù)量及F-actin環(huán)面積影響觀察

劉子歌,宋國(guó)瑞,張晨,李燕,劉心蕊,陳德勝

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川750004；2 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3 生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/寧夏生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院

人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)是人工全關(guān)節(jié)置換術(shù)后主要的長(zhǎng)期并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致翻修手術(shù)最常見的原因[1]，而骨溶解是無菌性松動(dòng)最突出的生物學(xué)表現(xiàn)。大量研究[2～4]表明，假體周圍的骨溶解是由假體部件之間的重復(fù)摩擦產(chǎn)生的磨損顆粒被巨噬細(xì)胞吞噬所導(dǎo)致的炎癥引起的。磨損顆粒激活的巨噬細(xì)胞可分泌多種促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、前列腺素E2等，由此引起的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是假體周圍骨溶解及隨后發(fā)生的無菌性松動(dòng)的主要原因，即所謂的“顆粒病”，進(jìn)而需要進(jìn)行二次翻修手術(shù)，這也是導(dǎo)致植入物失敗的主要原因之一。研究[5]顯示，TNF-α、IL-1β等炎癥因子會(huì)引起炎性骨吸收，抑制骨形成，最終導(dǎo)致骨溶解和無菌性松動(dòng)。白藜蘆醇是一種多酚，存在于葡萄、漿果和花生等多種飲食來源物中，有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種功能。有研究[6]證明，白藜蘆醇能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成和功能，抑制破骨細(xì)胞的生成。研究[7]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對(duì)軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用，可以延緩骨關(guān)節(jié)炎退變。在此基礎(chǔ)上，我們推測(cè)白藜蘆醇可以抑制假體磨損顆粒引起的假體周圍骨溶解和無菌性松動(dòng)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，2018年10月～2019年12月，我們觀察了白藜蘆醇對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)的體外破骨細(xì)胞生成及功能的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 白藜蘆醇、鈦顆粒、細(xì)胞及試劑 白藜蘆醇(C14H12O3，純度≥99.5%)購自美國(guó)MCE公司，商品純化鈦顆粒購自美國(guó)Alfa Aesar公司，小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國(guó)Gbico公司，TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)公司，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒購自美國(guó)Sigma公司，內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑盒購自廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司，CCK-8試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)公司，Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa生物公司，β-actin、p-p65、p-IκBα抗體購自美國(guó)Cell Signalling公司，鬼筆環(huán)鈦染色試劑購自武漢塞維爾公司，熒光顯微鏡、IX71光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料處理及濃度確定

1.2.1 鈦顆粒去除內(nèi)毒素 將鈦顆粒在180 ℃條件下焙烤6 h，加入75%乙醇，水平搖床晃動(dòng)48 h，離心后收集鈦顆粒并加入PBS并進(jìn)行高溫高壓再次滅菌，PBS重懸，采用鱟試劑盒進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，確保鈦顆粒內(nèi)毒素含量低于0.1 EU/mL，方可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)的鈦顆粒終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL[8]。

1.2.2 白藜蘆醇細(xì)胞毒性檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)濃度的確定 采用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。將RAW264.7細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板，加入不同濃度(0、1、5、10、15、20、30 μmol/L)白藜蘆醇干預(yù)后，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入10 μL CCK-8溶液，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入0、1、5、10、15、20、30 μmol/L白藜蘆醇后細(xì)胞增殖活性分別為1.000、1.020±0.009、1.029±0.011、1.010±0.008、0.979±0.009、0.957±0.009、0.870±0.022，其中加入1、5、10、15 μmol/L白藜蘆醇的細(xì)胞增殖活性與加入0 μmol/L白藜蘆醇的細(xì)胞增殖活性相比，P均>0.05。本研究選擇≤15 μmol/L的白藜蘆醇用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將RAW264.7細(xì)胞種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將RAW264.7細(xì)胞分為Sham組、Vehicle組、Low-Res組、Mid-Res組、High-Res組，后續(xù)試驗(yàn)處理時(shí)，Sham組加入完全培養(yǎng)基，Vehicle組加入鈦顆粒(0.1 mg/mL)+完全培養(yǎng)基，Low-Res組加入鈦顆粒(0.1 mg/mL)+完全培養(yǎng)基+白藜蘆醇(1 μmol/L)，Mid-Res組加入鈦顆粒(0.1 mg/mL)+完全培養(yǎng)基+白藜蘆醇(10 μmol/L)，High-Res組加入鈦顆粒(0.1 mg/mL)+完全培養(yǎng)基+白藜蘆醇(15 μmol/L)。

1.4 各組破骨細(xì)胞數(shù)與F-actin環(huán)面積測(cè)算 ①采用TRAP染色法檢測(cè)各組破骨細(xì)胞數(shù)。取各組細(xì)胞以1×104/孔接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，4%多聚甲醛固定，加入TRAP染液，置入37 ℃生物培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，堿性液沖洗干凈、晾干，按照Ping等[5]的方法，光鏡下觀察并計(jì)數(shù)破骨細(xì)胞數(shù)。②采用鬼筆環(huán)鈦染色法檢測(cè)各組破骨細(xì)胞F-actin環(huán)面積。取各組細(xì)胞以1×104/孔接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，加入4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100穿膜5 min，加入鬼筆環(huán)肽染色液在37 ℃生物培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，DAPI室溫染色細(xì)胞核5 min，沖洗干凈，封片，按照Roscher等[9]的方法，熒光顯微鏡下觀察并測(cè)算F-actin環(huán)面積。

1.5 各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β mRNA和蛋白檢測(cè) ①采用Realtime-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β mRNA。取各組細(xì)胞以1×104/孔/孔接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，TRIzol法提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行Realtime-PCR反應(yīng)。引物序列如下：TNF-α正向引物為5′-CCCTCACACTCAGATCATCTT-3′，反向引物為5′-CTGCTACGACGTGGGCTACAG-3′；IL-1β正向引物為5′-CCTCGTGCTGTCGGACCCATA-3′，反向引物為5′-CAGGCTTGTGCTCTGCTTGTGA-3′；β-actin正向引物為5′-AGGGTGTGATGGTGGGAATG-3′，反向引物為5′-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。②采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β蛋白。取各組細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)5天后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，800 r/min離心5 min去除Ti顆粒和細(xì)胞，分別使用TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中炎性破骨因子TNF-α和IL-1β。

1.6 各組細(xì)胞p-p65、p-IκB蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞以1×104/孔接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，用細(xì)胞蛋白試劑盒提取各組細(xì)胞的蛋白，BCA法定量，配置12%分離膠溶液，常規(guī)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1 h后，分別加入p-p65(1∶1 000)、p-IκB(1∶1 500)和β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃封閉過夜，加入二抗(1∶10 000)后用TBST稀釋，室溫孵育2 h，凝膠成像儀曝光，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組破骨細(xì)胞數(shù)與F-actin環(huán)面積比較 ①Vehicle組可觀察到較多體積較大、酒紅色、內(nèi)含多個(gè)細(xì)胞核的破骨細(xì)胞，而應(yīng)用不同濃度白藜蘆醇干預(yù)后，破骨細(xì)胞數(shù)隨著藥物濃度的增加而減少。Sham組、Vehicle組、Low-Res組、Mid-Res組、High-Res組破骨細(xì)胞數(shù)分別為0、(145.31±7.87)個(gè)、(129.63±4.12)個(gè)、(85.51±3.65)個(gè)、(69.76±5.63)個(gè)，其中Vehicle組和Low-Res組破骨細(xì)胞數(shù)相比，P>0.05，其余組間相比，P均<0.05。②Vehicle組可觀察到少量較大且呈綠色的F-actin環(huán),內(nèi)含多核細(xì)胞，細(xì)胞核被DAPI染呈藍(lán)色，細(xì)胞膜可見些許偽足，其中Low-Res組、Mid-Res組的F-actin環(huán)較Vehicle組略有減少，且細(xì)胞核減少，High-Res組多核細(xì)胞明顯減少。Sham組、Vehicle組、Low-Res組、Mid-Res組、High-Res組F-actin環(huán)面積分別為0、(3 642.31±987.01)μm2、(3 265.75±871.98)μm2、(2 497.45±712.61)μm2和(1 741.81±716.07)μm2，組間相比，P均<0.05。

2.2 各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

表1 各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 各組細(xì)胞中p-p65、p-IκB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞中p-p65、p-IκB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見表2。

表2 各組細(xì)胞中p-p65、p-IκB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

骨溶解的特征是磨損顆粒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的激活，從而導(dǎo)致體內(nèi)骨吸收與骨形成穩(wěn)態(tài)的失調(diào)。研究[10]表明，破骨細(xì)胞的過度活動(dòng)和骨吸收均與骨溶解密切相關(guān)。雖然許多細(xì)胞以各種方式參與這些病理過程，但破骨細(xì)胞是導(dǎo)致嚴(yán)重骨丟失并最終使假體松動(dòng)的惟一骨降解細(xì)胞。一般來說，不同類型的磨損顆粒會(huì)從假體接觸摩擦面產(chǎn)生，在人工關(guān)節(jié)中主要是金屬碎片或超高分子量聚乙烯顆粒，它們會(huì)招募包括巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞到骨-種植體界面，觸發(fā)一系列促炎細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而促進(jìn)周圍其他細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞產(chǎn)生更多細(xì)胞因子，加速假體周圍炎性微環(huán)境的形成[11]。在這些炎癥介質(zhì)中，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)在破骨細(xì)胞的激活中起著至關(guān)重要的作用。M-CSF維持單核/巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)，引導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，而RANKL結(jié)合到破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面核因子κB受體活化因子(RANK)后，激活下游信號(hào)通路，主要涉及NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致成熟的破骨細(xì)胞分化和隨后的骨吸收活動(dòng)。基于這些理論，我們認(rèn)為通過破骨細(xì)胞的主要信號(hào)通路來靶向破骨細(xì)胞的形成是治療骨溶解的一種有效可行的方法。

白藜蘆醇是一種在多種植物中發(fā)現(xiàn)的非黃酮類多酚化合物。最近的研究[6，12]證明，白藜蘆醇具有多種健康益處，例如心血管疾病和癌癥的預(yù)防。然而，這些保護(hù)機(jī)制還沒有得到充分的探索。有研究[13，14]指出，其保護(hù)作用的可能機(jī)制之一是通過下調(diào)炎癥反應(yīng)，包括抑制促炎介質(zhì)的合成和釋放、修飾二十烷類化合物的合成、抑制一些活化的免疫細(xì)胞或環(huán)氧合酶1和2，降低促炎介質(zhì)的合成。在本研究中，我們采用了磨損顆粒誘導(dǎo)下的體外破骨細(xì)胞形成模型來證明白藜蘆醇在骨溶解中的作用。為排除白藜蘆醇是通過對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用來影響破骨細(xì)胞形成的可能性。我們首先用不同濃度的白藜蘆醇對(duì)RAW264.7細(xì)胞干預(yù)72小時(shí)檢測(cè)各組的增殖活性，以評(píng)估白藜蘆醇的細(xì)胞毒性水平,結(jié)果顯示濃度≤15 μmol/L的白藜蘆醇對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖是沒有影響的。TRAP是破骨細(xì)胞特異性的標(biāo)志酶，TRAP染色是鑒定破骨細(xì)胞分化成熟的金標(biāo)準(zhǔn)，如果觀察到三個(gè)或以上細(xì)胞核同時(shí)TRAP呈現(xiàn)陽性(酒紅色)的細(xì)胞便可鑒定為是破骨細(xì)胞[15]。我們通過TRAP染色實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的白藜蘆醇對(duì)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響，我們發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用不同濃度白藜蘆醇干預(yù)后，染色呈陽性的破骨細(xì)胞數(shù)目隨著藥物濃度的增加而減少，且白藜蘆醇呈濃度趨勢(shì)抑制體外破骨細(xì)胞的成熟。此外，特征性F-actin環(huán)的形成是破骨細(xì)胞發(fā)揮骨吸收功能的前提條件，F(xiàn)-actin環(huán)錨定在礦化的基質(zhì)上，可以形成一個(gè)密閉的骨吸收腔，破骨細(xì)胞依靠其行使骨吸收功能[16]。因此，我們進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色以測(cè)試白藜蘆醇對(duì)F-actin環(huán)形成的影響，結(jié)果與TRAP染色結(jié)果相符，我們?cè)赩ehicle組可以清楚的觀察到大且清晰的F-actin環(huán)，然而用白藜蘆醇干預(yù)后，F(xiàn)-actin環(huán)的大小隨濃度而減少。結(jié)合TRAP的結(jié)果，我們認(rèn)為白藜蘆醇在體外可以抑制破骨細(xì)胞的功能與成熟，并且與白藜蘆醇的濃度有關(guān)。

炎性骨溶解所誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)主要是通過磨損顆粒自身刺激巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等分泌大量的TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子引起[17]。我們用ELISA法檢測(cè)了各組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β的分泌量，結(jié)果顯示白藜蘆醇能夠顯著抑制上述炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了白藜蘆醇良好的抗炎效果。同時(shí)，本研究Realtime-PCR結(jié)果表明，白藜蘆醇可顯著降低TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)，并呈濃度依賴性，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了我們ELISA的檢測(cè)結(jié)果。我們最后檢測(cè)了白藜蘆醇處理后IκBα和p65磷酸化蛋白的表達(dá)。IκBα作為IκB家族中最重要的成員之一，它調(diào)控的是NF-κB這一細(xì)胞通路中關(guān)于機(jī)體免疫與炎癥的途徑，其與p65/p50二聚體結(jié)合，抑制其活性[18]。本研究結(jié)果顯示，通過影響IκBα和NF-κBp65的磷酸化，白藜蘆醇抑制了鈦顆粒誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞中NF-κB通路的活化。

綜上所述，白藜蘆醇呈濃度依賴性對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7形成的破骨細(xì)胞數(shù)量及F-actin環(huán)面積產(chǎn)生抑制作用，其抑制作用的機(jī)制與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。這說明，白藜蘆醇可能是治療假體磨損顆粒引起的骨溶解的一種潛在選擇的治療藥物。