安徽地區(qū)不同規(guī)模豬場豬偽狂犬病毒感染情況調查與分析

黃曉慧 耿鶴鳴 李郁*

1.安徽農業(yè)大學動物科技學院 230036

2.安徽省合肥市動物疫病預防控制中心 230061

偽狂犬?。≒R）是由偽狂犬病病毒（PRV）感染引起的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的高度接觸性、急性傳染病[1-2]，我國將其列為二類動物疫病。豬是PRV的傳播者和自然宿主[3]，不同日齡豬感染PRV后臨床癥狀不同：母豬出現(xiàn)流產或產死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙疾病；新生仔豬表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、運動失調并伴有神經癥狀，死亡率可高達100%；成年豬感染后易發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病[4]。我國自1947年首次報道以來[5]，此病幾乎遍布我國大江南北，嚴重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。PRV主要通過母豬胎盤和公豬精液垂直傳播，也可水平傳播[6]。偽狂犬病病毒屬于雙股DNA病毒，為皰疹病毒科成員，動物一旦被其感染，病毒可在動物體內呈長期潛伏感染狀態(tài)，在受到體內或者外界因素的刺激后，往往可與其他病原體協(xié)同作用引起多種疾病的發(fā)生，從而引起疫病的爆發(fā)[7]。

疫苗免疫接種是控制偽狂犬病的重要手段，目前我國使用最為廣泛的是豬偽狂犬病毒gE基因缺失苗[8]。由于疫苗的使用，在近20年來豬偽狂犬病在我國得到有效的控制。自2011年以來，PRV變異毒株的出現(xiàn)導致豬偽狂犬病的發(fā)病率有上升趨勢[9]。為進一步了解安徽省偽狂犬病毒的感染情況，為防治偽狂犬病作出合理的評估。2013-2017年期間我們陸續(xù)收集或采集來自336個豬場的897份樣品，對偽狂犬病原進行了調查分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 897份病原檢測樣品來自安徽地區(qū)336個疑似感染PRV野毒的不同規(guī)模豬場的不同生長階段的豬。樣品包括病死豬以及病豬精液、血液、腦組織、腎臟、淋巴組織以及明顯病變其它臟器組織。樣品按照以下豬場規(guī)模及豬只生長階段進行歸類分析。

自繁自養(yǎng)型基礎母豬數大于3000頭為大型豬場，小于1000頭為中型豬場，小于100頭為小型豬場，小于10頭為散養(yǎng)戶。

豬只生長劃分為六階段，即哺乳仔豬（1周齡～4周齡）、保育豬（4周齡～8周齡）、育肥豬（9周齡以上）、種公豬、后備母豬及生產母豬。

1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒，OMEGA公司產品；2×GC-rich PCR Master Mix、無菌雙蒸水（ddH2O），北京天根生物科技公司產品；DNA Marker DL600、DNA Marker DL2000，Takara公司產品。

1.1.3 引物的設計與合成 根據GenBank上登錄的PRVgE基因序列（登錄號KP098534.1）設計一對特異性 引 物，P1：5’-CCGTGTTCTTTTGGCGGTG-3’，P2：5’-ACCTCCTCGCCGAAGGCGTCGAAG-3’，目的片段大小為423bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 待檢病料的準備 主要采集病豬的腦組織、腎臟、淋巴組織以及明顯病變其它臟器組織等，研磨后，反復凍融3次，5000r/min離15min，取上清液，置于-20℃保存。

1.2.2 PCR檢測 根據OMEGA的Micro Elute Genomic DNA Kit(50)DNA提取試劑盒的操作步驟提取PRV病毒的基因組DNA。提取的DNA直接進行病毒基因檢測，反應體系如下：2×Taq plus PCR Master Mix 12.5μL（Taq DNA 聚合酶、dNTPs 、標準Taq反應緩沖液），上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板3μL，ddH2O7.5μL。反應條件為：94℃預變性4min；94℃變性1min；63℃退火1min；72℃延伸 1min，40個循環(huán)；72℃延伸10min。取5μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察試驗結果。

1.2.3 結果判定 PCR病原檢測結果判定PRV陽性對照出現(xiàn)423bp擴增帶，陰性對照無條帶出現(xiàn)時，試驗結果成立。被檢樣品出現(xiàn)423bp擴增帶為陽性，否則為陰性。

1.2.4 數據分析 采用SPSS statistics 20.0，對數據進行統(tǒng)計分析。利用單因素方差分析LSD多重比較與卡方檢驗進行數據間比對，將數據進行分類，進而將每一類別數據中的數據組進行單因素方差分析，當p≥0.05時說明數據中不存在顯著性差異，p＜ 0.05時說明比較的兩組數據間存在顯著性差異，若p＜ 0.01時則兩組數據間差異極顯著。

2 結果

2.1 PRV gE基因PCR檢測結果 對897份發(fā)病豬樣品進行PRV gE-PCR檢測，結果共檢出PRV核酸陽性樣品139份，總體陽性率為15.50%。部分豬場的PCR陽性病料檢測檢測結果見圖1。

圖1 PRV gE基因PCR擴增結果

2.2 不同年份PRV檢出情況 2013年、2014年、2015年、2016年與2017年的PRV陽性檢出率分別為1.11%（1/90）、5.35%（9/168）、28.64%（55/192）、21.39%（43/201）、12.60%（31/246）。2013年、2014年之間差異不顯著，2014-2015年病原陽性檢出率呈上升趨勢；2015年的病原陽性檢出率最高且與其他年份對比差異顯著。2016-2017年的病原陽性檢出率開始下降且差異顯著，但病原陽性檢出率始終高于2013年與2014年（表1）。

表1 不同年份PRV陽性檢出率

2.3 不同生長階段PRV檢出情況 將送檢病料生長階段清晰的樣品653份樣品進行分類檢測，PRV陽性檢出率分別為仔豬17.90%（29/162）、保育24.42%（32/132）、育肥14.51%（9/62）、母豬（48/206）、公豬18.68%（17/91），不同生長階段的PRV陽性檢出率差異不顯著（表2）。

2.4 不同規(guī)模豬場豬群PRV檢測結果 不同規(guī)模養(yǎng)殖場的PRV檢測結果（表3）顯示安徽地區(qū)不同規(guī)模養(yǎng)殖場均存在PRV的野毒感染，小規(guī)模養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶的抗體陽性率最高為19.88%（34/171），大規(guī)模養(yǎng)殖場和中等規(guī)模養(yǎng)殖場陽性率分別為12.87%（35/272）、15.38%（18/117）。小規(guī)模養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶與大規(guī)模養(yǎng)殖場、中等規(guī)模養(yǎng)殖場比較差異極顯著（p＜ 0.01）。

3 討論

本次調查分析的897份樣品來自安徽地區(qū)336個疑似感染PRV野毒的不同規(guī)模豬場，結果顯示所有收檢樣品PRV野毒陽性率為15.50%；說明安徽地區(qū)豬場確實存在PRV野毒的感染，對豬場豬群整體健康造成極大的危害，急需制定有效措施進行防控。近年來，PRV野毒在我國豬場中仍普遍存在，并保持一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，不同豬場PRV野毒感染陽性率差異較大，尤其是2012年以來，PR的發(fā)病率有上升趨勢，但是沒有大規(guī)模的爆發(fā)，呈地方流行性。

表2 不同生長階段PRV病原陽性檢出率

表3 不同規(guī)模豬場豬群PRV陽性檢出率

安徽地區(qū)不同規(guī)模養(yǎng)殖場PRV陽性率的對比結果表明，小規(guī)模養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶的病原陽性率最高，大規(guī)模養(yǎng)殖場和中等規(guī)模養(yǎng)殖場病原陽性檢出率較低且二者不存在顯著性差異。這可能與小規(guī)模養(yǎng)殖場與散養(yǎng)戶由于資金及技術的限制不能有效監(jiān)控病毒的傳播，往往在豬群發(fā)病時才能發(fā)現(xiàn)豬群感染了PRV，造成隱形感染和帶毒豬長期共存而互相感染。同時其生產管理水平也相對薄弱，缺乏有效的隔離檢疫制度，對偽狂犬病的防控意識及防控措施均重視不夠。

由不同生長階段豬的PRV野毒感染陽性率統(tǒng)計分析結果可知，母豬、哺乳仔豬、保育豬、中大豬均有檢出，說明不同生長階段的豬群對PRV均易感。保育豬豬群的PRV野毒檢出率最高，且這一階段的豬群PRV的發(fā)病率和死亡率都很高，這提示我們保育仔豬免疫受到母源抗體干擾等因素，造成免疫效果不佳，成為高風險的易感豬群。其次母豬群較高的PRV感染會造成整個豬場偽狂犬病毒的持續(xù)性感染，因為母豬飼養(yǎng)時間較長，一旦感染PRV野毒，可長期帶毒排毒。制定合理的免疫程序，免疫接種能夠有效的降低感染的發(fā)生，減少病毒擴散，有計劃的實行PRV的凈化工作，降低母豬群的PRV野毒感染至陰性狀態(tài)。

疫苗免疫接種是控制該病的主要方法，選擇使用具有較強抗?jié)摲腥灸芰Φ幕蛉笔醵疽呙鐚τ趥慰袢】刂瓶赡芨袔椭?。而我省不同地區(qū)、不同豬場種豬偽狂犬陽性率的差異可能與選擇不同的疫苗有一定關系。但是僅僅依靠疫苗免疫并不能徹底控制偽狂犬病的流行，為有效預防和控制該病的發(fā)生與流行，應借鑒發(fā)達國家消滅豬偽狂犬病的成功經驗，引導豬場采取綜合防控措施：1）堅持自繁自養(yǎng)、全進全出的養(yǎng)殖模式。2）嚴格引種管理，做好隔離檢疫工作，從源頭上切斷病原。3）定期監(jiān)測PRV野毒感染抗體，結果病原學檢測結果，及時剔除陽性動物，凈化種群。4）加強豬場的飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)保健，以提升群體抗病能力。此外，還應加強豬場的滅鼠、消毒工作，嚴格禁止外來人員及車輛?？傊s化、規(guī)?；B(yǎng)殖場是今后養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展方向，而集約化養(yǎng)殖無疑對于傳染病的控制有著更高的要求。對于偽狂犬的控制，我們的最終目標是逐步凈化以達到最終的清除，促進養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。