禽流感與雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)操作方法及注意事項(xiàng)

石蓉/廣西柳州市三江侗族自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 545500

禽流感、雞新城疫均是家禽養(yǎng)殖過程中的常見疫病，一旦發(fā)生將會(huì)是養(yǎng)殖戶承受較大經(jīng)濟(jì)損失。HA、HI是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)禽類免疫抗體水平、規(guī)劃免疫最佳時(shí)機(jī)的常用手段，目前在基層有較廣泛應(yīng)用。但人為操作規(guī)范性、選用標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確度、材料標(biāo)準(zhǔn)性等諸多因素還會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。故而，相關(guān)人員一定要扎實(shí)掌握試驗(yàn)操作要點(diǎn)及相關(guān)注意事項(xiàng)等，力求從根本上保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，為防控家禽疫病提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 采集與處理血樣

首先，在血清學(xué)檢測(cè)以及試驗(yàn)研究階段，采血均是最基礎(chǔ)工作項(xiàng)目，采血工作質(zhì)量直接關(guān)系著能否順利進(jìn)入試驗(yàn)過程及結(jié)果判斷情況。在采血期間，要求采血人員在加強(qiáng)自身防護(hù)基礎(chǔ)上，要嚴(yán)格依照相關(guān)規(guī)程對(duì)采血設(shè)施做出消毒、干燥處理，無菌采樣。

其次，分離血清階段中，要靜置、傾斜放置試管，將血清析出溫度控制在23℃以上，血樣基本上能在2h中就可以離析出顏色透亮的血清。若檢測(cè)到溫度在10℃上下波動(dòng)時(shí)，建議快速把試管安放在37℃培養(yǎng)箱持續(xù)2～3h[1]。要求相關(guān)人員在送樣期間不能出現(xiàn)劇烈晃動(dòng)血樣的行為，以防出現(xiàn)溶血情況，待血樣被安全送到實(shí)驗(yàn)室以后，要快速分離血清，針對(duì)無法即刻分離的血清要予以冷藏處理，若發(fā)現(xiàn)血清樣品有溶血、膠凍等情況，則要堅(jiān)決棄用。

最后，部分家禽血清雞紅細(xì)胞可能會(huì)形成非特異性聚集情況，進(jìn)而誘導(dǎo)了假陽性反應(yīng)。故而，建議選用待檢血清作為血凝試驗(yàn)，若觀測(cè)到待檢血清形成凝集紅細(xì)胞，則提示存有非特異凝集素，建議快速采用雞紅細(xì)胞做出吸附處理。方法如下：量取等體積的雞紅細(xì)胞與家禽血清充分混合30min，而后提起清液開展HI試驗(yàn)。判斷試驗(yàn)結(jié)果期間，相關(guān)會(huì)發(fā)現(xiàn)其和原方法會(huì)高一個(gè)滴度。這提示在HI階段，應(yīng)依照病毒類型及血清來源等信息，及時(shí)采用相應(yīng)處理方法。

2 相關(guān)注意事項(xiàng)

2.1 科學(xué)選擇反應(yīng)板 推薦使用90°有機(jī)血凝板，要求在試驗(yàn)整體結(jié)束后，嚴(yán)格依照說明書上提出的內(nèi)容清晰反應(yīng)板，確保清潔度符合相關(guān)規(guī)范要求。當(dāng)下，很多實(shí)驗(yàn)室頻繁采用一次性V型塑料反應(yīng)板，用過后無需予以洗刷處理。試驗(yàn)階段，影加強(qiáng)反應(yīng)板質(zhì)量的控制，以防存留問題而導(dǎo)致結(jié)果偏離。

2.2 合理選用稀釋液 HA、HI試驗(yàn)階段，為將稀釋液對(duì)檢測(cè)結(jié)果精確度形成的影響降至最低，建議選擇符合pH7.2、0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS），其用于以上兩項(xiàng)試驗(yàn)研究中取得的效果優(yōu)于生理鹽水[2]。

2.3 加樣階段的注意事項(xiàng) 首先，在取樣環(huán)節(jié)中，要求移液器只需按至首個(gè)檔停點(diǎn)，排樣階段要求按至第2檔停點(diǎn)，方能保證樣品整體排出，從根本上保證取樣量的準(zhǔn)確度。其次，吸取液體時(shí)，松開拇指的速度要遲緩，過程要平穩(wěn)，切忌出現(xiàn)過快速放開的操作。與此同時(shí)，順沿沿器壁滑出吸頭，以上操作的宗旨是剔除除吸頭外部吸附的多余液體。再者，加樣階段，切忌吸頭與V板孔兩者相觸及，這是減少或規(guī)避交叉污染情況的最基礎(chǔ)操作。按照一定比例稀釋樣品過程中，要求操作人員用拇指緩慢按壓、松開移液器按鈕，以防形成數(shù)目過多的泡沫，降低移液量的準(zhǔn)確度，混合均勻性欠佳，對(duì)試驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)量形成負(fù)面影響。最后，實(shí)際檢測(cè)工作中，可能在限定在某時(shí)段中要求完成一批次血清多種毒株或亞型檢測(cè)的任務(wù)，為規(guī)避不同抗原液混淆情況，要求一定要對(duì)盛放抗原也的加樣槽壁上做出特殊標(biāo)識(shí)。因?yàn)橐淮卧囼?yàn)階段，需要采用數(shù)塊反應(yīng)板設(shè)施，也應(yīng)予以標(biāo)識(shí)。

綜上所述，采用HA、HI試驗(yàn)檢測(cè)禽流感與雞新城疫病毒，多種因素會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的精確度。故而，要求相關(guān)人員在試驗(yàn)活動(dòng)中，應(yīng)嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，嚴(yán)格依照規(guī)范要求配制紅細(xì)胞懸液，并合理調(diào)控試驗(yàn)溫度以及時(shí)間長(zhǎng)度，力爭(zhēng)將各種因素形成的影響降至最低水平。