PCI后冠心病患者氯吡格雷低反應的相關因素分析

欣明花 鐘誠 何浪 劉小慧 張晶 沈法榮

血小板在血栓形成的病理生理中起關鍵作用。 二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）是激活血小板的激活劑，ADP通過G蛋白偶聯受體CYP2C19和陽離子通道偶聯P2X1受體與相鄰的血小板結合[1-2]。ADP激活CYP2C19受體會釋放Gi蛋白亞基aGi和bg，進而導致持續(xù)的血小板聚集[3]。噻吩并吡啶類是ADP P2C19受體的不可逆抑制劑。噻氯匹定是第一代噻吩并吡啶，與阿司匹林合用已顯示出對預防冠狀動脈支架植入術后血栓并發(fā)癥的預防作用。氯吡格雷是第二代噻吩并吡啶，具有相似的功效，由于其具有更好的耐受性，已在很大程度上取代了噻氯匹定，目前是預防冠狀動脈支架植入術后血栓形成的首選抗血小板治療藥物[4]。血小板對氯吡格雷反應的變異性及臨床相關性已有較多研究，但是，潛在機制仍不清楚。研究證明CYP2C19ADP受體的遺傳多態(tài)性可能影響該受體激活或患者對血小板抑制劑的反應[5-6]。在CYP2C19基因中發(fā)現了許多單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），這解釋了ADP誘導的血小板聚集的個體間差異[7]。CYP2C19多態(tài)性與血小板聚集增強相關，提示可能會改變氯吡格雷反應[8-9]。本研究擬確定CYP2C19基因多態(tài)性的頻率，并評估冠心病患者經PCI后的氯吡格雷低反應特征及其與CYP2C19基因多態(tài)性的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1對象 選取2016年3月至2018年9月本院行經皮冠狀動脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI）治療的急性冠脈綜合征患者164例，其中男91例，女73例，年齡45～75（61.12±18.38）歲。納入標準：符合《急性冠脈綜合征的診斷和治療》中的診斷標準，經冠狀動脈造影確診；PCI治療成功，患者預計術后生存時間＞3年；年齡≥30歲。排除標準：嚴重心血管疾病；對氯吡格雷過敏；低血壓患者：收縮壓＜90 mmHg、舒張壓＜50 mmHg；研究前3個月有手術史；紅細胞壓積＜30%，血小板計數＜100×109/L。本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 分組方法 所有患者根據具體病情于PCI術前1 d給予阿司匹林（商品名：拜阿司匹靈，德國拜耳醫(yī)藥保健公司生產，批號：BJ41073）100～300 mg/d+負荷量氯吡格雷［商品名：波立維，賽諾菲安萬特（杭州）制藥有限公司，批號：4200350］300 mg/d，術后分別予100 mg/d、75 mg/d的維持劑量治療，阿司匹林長期服用，氯吡格雷連續(xù)服用12個月。根據血小板凝集檢測結果分為氯吡格雷正常反應組（CNR組，血小板聚集率≥10%）96例；氯吡格雷低反應組（CLR組，血小板聚集率＜10%）68例。

1.2.2 血小板聚集率檢測方法 采用光凝集法（Chrono-log Model 490）評估血小板凝集。采集患者外周血，分為兩個樣本：第1個代表基線血小板凝集（服用氯吡格雷之前），第2個代表在給予氯吡格雷負荷劑量后1周的血小板凝集。血小板聚集率=服藥前最大血小板聚集率-服藥后7 d最大血小板聚集率。在檸檬酸鹽右旋糖上真空收集血液以抑制凝血。在25℃下以400 g離心10～15 min制備富含血小板的血漿（platelet-rich plasma，PRP），將PRP取出，放入帶塞子的塑料管中，測定ADP誘導的血小板聚集。將剩余血漿以3 000 g離心10 min制備貧血小板血漿（platelet-pleted plasma，PPP）。將PRP在37℃的比色杯中攪拌，并將比色杯置于光程和光電管之間。當添加ADP時，血小板聚集吸收折射光，可被光電管檢測到。最初的結合導致細胞內鈣釋放和血小板形狀改變，從而導致主要聚集波；二次波反映血小板儲存顆粒中ADP的釋放。

1.2.3CYP2C19基因型多態(tài)性測定 通過Fermentas基因組DNA純化試劑盒（美國Sigma公司，＃K0721，＃K0722）從外周血提取基因組DNA。在裂解溶液中用蛋白酶K消化樣品。通過RNase A處理樣品除去RNA。然后將裂解液與乙醇混合，并加載到DNA與硅膠膜結合的純化柱上。用準備好的洗滌緩沖液洗滌色譜柱去除雜質。然后在低離子強度條件下用洗脫緩沖液洗脫基因組DNA。通過PCRRFLP法進行基因分型。試劑和引物由美國Qiagen公司提供。DreamTaq Green PCR MasterMix（2X）包含DreamTaq DNA聚合酶，優(yōu)化的DreamTaq Green緩沖液，MgCl2和dNTP。CYP2C19基因特異性引物：正向引物5’-TCTGGTGAAATAAAAAGATTACGTA-3’，反向引物5’-GTCAGAAATGGCCTGTGTATATATG-3’。T3000 PCR儀用于P2C19受體基因擴增：在94℃進行5 min的初始熱變性；以下程序進行35個循環(huán)：在94℃變性30 s，在50℃退火30 s，擴展72℃30 s；最后一個循環(huán)中，在72℃下延長至5 min。使用凝膠電泳（Compact XS/S Biometra）在2%瓊脂糖凝膠上平行運行樣品，并采用UV透射儀檢測是否存在DNA條帶，經CYP2C19*2、CYP2C19*3位點酶切產物電泳圖像分析基因型：在A等位基因下產生196 bp和24 bp的2個片段，G等位基因的單個220片段。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用多因素logistic逐步回歸模型分析冠心病行PCI術患者氯吡格雷低反應的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1兩組患者一般資料比較 見表1。

表1兩組患者一般資料比較

由表1可見，CLR組BMI、2型糖尿病史比例高于CNR組，總膽固醇水平低于CNR組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），其余指標差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.2CYP2C19*2、CYP2C19*3基因型頻率及等位基因頻率比較 見表2。

表2 CYP2C19*2、CYP2C19*3基因型頻率及等位基因頻率比較[例（%）]

由表2可見，CYP2C19*2與CYP2C19*3GG、GA、AA基因型頻率分布比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；CYP2C19*2與CYP2C19*3G、A等位基因頻率分布比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3兩組患者基因型頻率及等位基因頻率比較見表3。

表3兩組患者基因型頻率及等位基因頻率比較

由 表3可 見，與CNR組 比 較，CLR組CYP2C19*2GG基因型頻率降低，GA、AA基因型頻率升高，G等位基因頻率降低，A等位基因頻率升高（均P＜0.05）；與CNR組比較，CLR組CYP2C19*3GG、GA、AA基因型頻率，G、A等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.4氯吡格雷低反應的危險因素分析 見表4。

表4氯吡格雷低反應的危險因素分析

由表4可見，以冠心病PCI術患者氯吡格雷干預后低反應為因變量（是=1，否=0），單因素分析有統(tǒng)計學意義的因素為自變量進行多因素logistic逐步回歸分析，結果發(fā)現BMI、2型糖尿病史、CYP2C19*2均為冠心病PCI術患者氯吡格雷低反應的危險因素（OR=2.48、4.27、13.68，均P＜0.01）。

3 討論

雙重抗血小板治療（dual antiplatelet therapy，DAPT）是急性冠脈綜合征和PCI后的主要治療手段。阿司匹林雖然有效，但單獨治療效果不佳，與3種噻吩并吡啶結合使用效果較好。在噻吩并吡啶類藥物中，氯吡格雷是最常用的處方藥，與單獨使用阿司匹林相比，其成本更低且療效更好。氯吡格雷的主要缺點是其生物利用度的高度可變性[10]。

CYP2C19基因的幾個變體影響氯吡格雷前藥向其活性形式的轉化，從而改變個體的血小板反應性。CYP2C19基因編碼ADP受體P2C19，為氯吡格雷的藥理靶標[11-12]。CYP2C19SNP，特別是CYP2C19*2、CYP2C19*3SNP與冠狀動脈粥樣硬化性疾病的相關性仍在研究中。P2C19受體的遺傳變異已被認為是冠狀動脈疾病患者氯吡格雷反應變異的基礎機制[13]。研究證明，CYP2C19基因多態(tài)型（*2，*3，*17，*1）對氯吡格雷的生物利用度具有深遠影響。CYP2C19基因型（*2，*3）者氯吡格雷生物利用度缺乏；CYP2C19基因型（*1/*2，*1/*3，*2/*17和*3/*17）者生物利用度降低，但仍具有抑制血小板活性的能力；CYP2C19基因型（*1/*17、*17/*17）者氯吡格雷生物利用度高于正常水平[14-15]。研究表明，CYP2C19基因型（*2，*3）可導致活性形式的氯吡格雷有效性降低，心血管死亡風險增加55%～76%，心肌梗死或中風以及支架血栓形成風險增加2.6～4.0倍[16]。

本研究發(fā)現，164例患者中CYP2C19*2GG、GA、AA基因型頻率分別為47.5%、32.9%、19.6%，CYP2C19*3GG、GA、AA基因型頻率分別為90.2%、4.9%、4.9%；CYP2C19*2G、A等位基因頻率分別為64.0%、36.0%，CYP2C19*3G、A等位基因頻率分別為92.7%、7.3%。結果與Cavallari等[7]的研究結果相似，該研究發(fā)現，冠心病患者中CYP2C19*2GG、GA、AA基因型的頻率分別為42.31%、30.67%和27.02%。研究表明，CYP2C19*2（G→A）屬于堿基變異，可改變mRNA閱讀框架，使翻譯過程中出現錯誤剪接位點；而CYP2C19*3（G→A）可提前形成終止密碼，導致酶活性喪失[17-18]。本研究發(fā)現，與CNR組比較，CLR組CYP2C19*2GG基因型頻率降低，GA、AA基因型頻率升高，G等位基因頻率降低，A等位基因頻率升高；與CNR組比較，CLR組CYP2C19*3GG、GA、AA基因型頻率，G、A等位基因頻率分部無明顯改變。這說明，冠心病患者經PCI治療后的氯吡格雷低反應與CYP2C19*2G等位基因頻率降低，A等位基因頻率升高有關；而可能與CYP2C19*3等位基因無關，本研究臨床樣本較少，后期需擴大樣本進一步證實。

除CYP2C19基因型外，其他一些因素也會影響氯吡格雷的生物利用度。這些方面包括藥物吸收的變化、糖尿病合并癥，高BMI、低LVEF和藥物相互作用[19]。高BMI是冠心病PCI術患者氯吡格雷低反應的獨立影響因素，可能與肥胖患者體內凝血因子活性較高，一定程度上會導致血小板聚集率增加，心血管疾病發(fā)生率高有關，通過增加氯吡格雷劑量可能會逆轉氯吡格雷低反應，這將在后續(xù)研究中進行。因此，血小板反應性監(jiān)測已被證明可有效減少普拉格雷或替卡格雷患者PCI治療后的并發(fā)癥。本研究多因素logistic逐步回歸分析顯示：BMI、2型糖尿病史、CYP2C19*2均為冠心病PCI術患者氯吡格雷低反應的危險因素，與上述研究結果一致。

綜上所述，冠心病患者經PCI治療后的氯吡格雷低反應與CYP2C19*2基因多態(tài)性有關，建議使用CYP2C19基因多態(tài)性檢測來指導抗血小板治療，BMI、2型糖尿病史、CYP2C19*2均為冠心病PCI術患者氯吡格雷低反應的危險因素。