伊馬替尼-槲皮素共無定型納米制劑的制備與表征*

王雪，張寶喜，胡堃，龔寧波，呂揚(yáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所、晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種世界范圍內(nèi)罕見的造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，發(fā)病率為1～2/10萬人口，約占成人白血病的15%[1-2]。CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)是斷裂點(diǎn)簇集區(qū)-埃希爾森小鼠白血病病毒癌基因同源物(breakpoint cluster region-Abelson murine leukemia viral oncogene homolog,BCR-ABL)融合基因編碼的蛋白具有高酪氨酸激酶活性，從而使細(xì)胞處于過度增殖且凋亡受阻的狀態(tài)[3-5]。伊馬替尼(imatinib)主要通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制酪氨酸激酶活性從而有效治療CML，但仍對(duì)部分患者治療效果不佳[6]。近年來，靶向藥物聯(lián)合生物素治療腫瘤逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7]，國內(nèi)有研究表明伊馬替尼聯(lián)合槲皮素可協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4-5，7]，具有較好的開發(fā)潛力，但由于伊馬替尼和槲皮素的水溶性較差，導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制。為了解決這一難題，采用制備納米制劑來改善藥物溶解性成為第一選擇。

納米藥物技術(shù)是增加難溶性藥物溶解度的有效途徑[8]。通過納米制備技術(shù)，藥物粒徑為納米級(jí)別，表面積顯著增大，藥物溶解度增加[9]。多項(xiàng)研究表明，納米包封能增加伊馬替尼對(duì)癌細(xì)胞的療效，減輕其對(duì)心臟的毒副作用[10-11]，常見的納米化技術(shù)主要包括反溶劑法、乳化溶劑揮發(fā)法、超臨界流體法、高壓均質(zhì)法以及噴霧干燥法等[12-13]。筆者在本研究采用加熱攪拌法，得到伊馬替尼-槲皮素的共無定型物。為提高共無定型物的溶解度，選取聚維酮K30作為穩(wěn)定劑，聯(lián)合應(yīng)用反溶劑沉淀法[14]與冷凍干燥法得到伊馬替尼-槲皮素的納米制劑，并對(duì)其進(jìn)行分析表征和飽和溶解度評(píng)價(jià)。

1 材料與儀器

1.1儀器 XS-105 型分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)；FDU-1100真空冷凍干燥機(jī)(東京理化EYELA公司)；D/max-2550型粉末X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；1/500型差示掃描量熱儀(瑞士梅特勒-托利多儀器公司)；ZetasizerNano S90型高靈敏納米粒度分析儀(英國馬爾文公司)；Spectrum400 型傅里葉紅外光譜儀(英國PerkinElmer公司)；1200型高相液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)。

1.2藥品與試劑 伊馬替尼原料藥(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20190614，含量>98.0%)；二水合槲皮素原料藥(陜西慧科植物開發(fā)有限公司，批號(hào)：20080106，含量>98.0%)；聚維酮K30(PVP K30，西安天正藥用輔料有限公司，批號(hào)：20160602，醫(yī)藥項(xiàng))；娃哈哈純凈水、甲醇、乙腈，實(shí)驗(yàn)過程中所用溶劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1伊馬替尼-槲皮素共無定型物制備 精密稱取伊馬替尼原料藥493.6 mg，二水合槲皮素原料藥338.3 mg，溶解于甲醇溶液30 mL中，在溫度為80℃，300 r·min-1條件下加熱攪拌至全部溶解，將所得溶液趁熱過濾，濾液繼續(xù)攪拌至溶液揮干，獲得亮黃色粉末，即為摩爾比為1：1的伊馬替尼-槲皮素共無定型物樣品。

2.2伊馬替尼-槲皮素納米制劑制備 實(shí)驗(yàn)采用反溶劑沉淀法制備納米制劑。稱取PVPK30原料藥40 mg，加入純化水20 mL溶解，制成穩(wěn)定劑，將伊馬替尼-槲皮素共無定型物樣品50 mg溶于甲醇溶液5 mL中，在室溫下將穩(wěn)定劑溶液20 mL在300 r·min-1轉(zhuǎn)速下攪拌，用注射器將伊馬替尼-槲皮素共無定型物的甲醇溶液緩慢注入，繼續(xù)攪拌10 min，獲得混懸液。將混懸液濾過后，采用冷凍干燥法除去溶劑后獲得黃色粉末狀固體，即為伊馬替尼-槲皮素納米制劑。

2.3分析表征實(shí)驗(yàn)

2.3.1粉末X射線衍射分析 分別稱取伊馬替尼-槲皮素物理混合物(以下簡(jiǎn)稱物理混合物)、伊馬替尼-槲皮素共無定型物(以下簡(jiǎn)稱共無定型物)、伊馬替尼-槲皮素納米制劑(以下簡(jiǎn)稱納米制劑)各50 mg，研磨過篩后置于樣品架中，采用粉末X射線衍射儀進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1(A)。共無定型物和納米制劑的粉末X射線衍射圖譜中衍射峰均為彌散峰，晶型狀態(tài)與物理混合物完全不同，表明制備產(chǎn)物中均為共無定型狀態(tài)。

2.3.2差示掃描量熱分析 采用差示掃描量熱儀對(duì)物理混合物、共無定型物、納米制劑3種樣品各2.5 mg進(jìn)行分析，獲得3種物質(zhì)的熱分析結(jié)果見圖1(B)。DSC曲線顯示，共無定型物和納米制劑在兩種藥物的熔點(diǎn)處均沒有吸熱峰出現(xiàn)，證實(shí)其形成了新的無定型態(tài)物質(zhì)。

2.3.3紅外光譜分析 稱取物理混合物、共無定型物、納米制劑3種樣品各5 mg，分別采用紅外光譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1(C)。相比共無定型物(曲線a)和納米制劑(曲線b)，物理混合物(曲線c)中槲皮素的羥基(-OH)在3393 cm-1的伸縮振動(dòng)特征峰和伊馬替尼的氨基(-NH)在3279 cm-1的伸縮振動(dòng)特征峰均減弱或消失，提示伊馬替尼-槲皮素新共晶物質(zhì)的生成與兩個(gè)基團(tuán)形成新的弱相互作用有關(guān)。

2.4粒度分析 稱取共無定型物和納米制劑各5 mg，加純凈水稀釋后，采用納米粒度分析儀對(duì)兩者的粒徑進(jìn)行分析。粒徑分析結(jié)果見圖2。共無定型物平均粒徑為(1600.0±20.7)nm，分散指數(shù)(PDI)=0.158(曲線a)，納米制劑的平均粒徑為(157.3±4.5)nm，PDI=0.135(曲線b)，表明伊馬替尼-槲皮素形成納米制劑，且粒度分散均勻。

a.共無定型物；b.納米制劑；c.物理混合物。

2.5含藥量測(cè)定

2.5.1高效液相色譜法測(cè)定 伊馬替尼和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別精密稱取伊馬替尼和槲皮素原料藥各50 mg，置于50 mL量瓶，加入甲醇溶解并定容，制成伊馬替尼和槲皮素儲(chǔ)備液。精密量取一定量的儲(chǔ)備液，加入甲醇稀釋配制成濃度分別為1，5，10，25，50，100，200，500，800，1000 μg·mL-1的伊馬替尼和槲皮素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。選用流動(dòng)相為乙腈和0.2%的磷酸水溶液梯度洗脫10 min，檢測(cè)波長為272 nm，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。色譜圖見圖3，伊馬替尼和槲皮素的峰形對(duì)稱性較好，無拖尾現(xiàn)象，出峰時(shí)間分別為3.635和8.773 min。記錄出峰時(shí)間和峰面積，分別以伊馬替尼和槲皮素的濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)得到兩種原料藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線。伊馬替尼的線性回歸方程為A=14.329C+104.64，R2=0.999 1(n=10)，槲皮素的線性回歸方程為A=15.823C+202.11，R2=0.999 2(n=10)。兩者均具有良好的線性關(guān)系，可以用于藥物含藥量的測(cè)定和溶解度實(shí)驗(yàn)分析。

2.5.2納米制劑含藥量的測(cè)定 精密稱取納米制劑5 mg，加甲醇定容至1 mL，采用HPLC法測(cè)定藥物的峰面積，結(jié)果見表1。經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得納米制劑中伊馬替尼的含藥量為20.21%，槲皮素的含藥量為3.53%。其中含藥量D(%)通過公式(1)計(jì)算獲得[15]。

表1 納米制劑中伊馬替尼和槲皮素的含藥量

D(%)=m(伊馬替尼或槲皮素)m總×100%(1)

2.6飽和溶解度的測(cè)定 分別稱取伊馬替尼原料藥、槲皮素原料藥、共無定型物和納米制劑各30 mg，加入水5 mL，超聲溶解20 min后制成過飽和溶液，置于溫度37 ℃的恒溫振蕩箱中，以100 r·min-1的轉(zhuǎn)速振蕩12 h，將得到的溶液用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過后，采用HPLC法進(jìn)行分析，分析方法與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用方法一致，結(jié)果見表2，納米制劑中伊馬替尼的飽和溶解度為524.3 μg·mL-1，槲皮素的飽和溶解度為113.3 μg·mL-1；共無定型物中伊馬替尼的飽和溶解度為38.7 μg·mL-1，未檢測(cè)到槲皮素；伊馬替尼原料藥的飽和溶解度為60.1 μg·mL-1，槲皮素原料藥未檢測(cè)到色譜峰。分析結(jié)果顯示，納米制劑中伊馬替尼的飽和溶解度相比共無定型物和原料藥均有顯著提高，分別提高13.5倍和8.7倍；納米制劑中槲皮素的飽和溶解度也有明顯改善。

表2 納米制劑、共無定型物以及原料藥的飽和溶解度

a.共無定型物；b.納米制劑。

A.伊馬替尼；B.槲皮素。

3 討論

本文采用加熱攪拌法成功制備獲得伊馬替尼-槲皮素的共無定型物，為兩者聯(lián)合應(yīng)用提供共晶物質(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)在獲得新的共晶物質(zhì)狀態(tài)基礎(chǔ)上，采用反溶劑沉淀法和冷凍干燥法成功制備獲得納米制劑。與其他伊馬替尼-槲皮素的納米制劑[16]比較，本研究通過冷凍干燥法獲得納米制劑，更能保證物質(zhì)的納米狀態(tài)，從而使伊馬替尼和槲皮素的含藥量均有顯著提高；與共無定型物以及原料藥比較，本研究所得納米制劑具有粒徑小、分布均勻、飽和溶解度大等優(yōu)勢(shì)；與單一成分伊馬替尼或槲皮素納米制劑相比，作為共晶物質(zhì)，該納米制劑中槲皮素可與伊馬替尼協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4-5]，在改善藥物理化性質(zhì)和共晶藥物開發(fā)等方面具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。研究結(jié)果為抗腫瘤藥物的共晶物質(zhì)探索開發(fā)和改善成藥性研究提供了新思路。