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    蘆根多糖誘導自噬和凋亡抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖

    2020-08-10 01:56:56鄧小娟敖素華
    醫(yī)藥導報 2020年8期
    關(guān)鍵詞:肺癌小鼠

    鄧小娟,敖素華

    (1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院門診部,成都 610072;2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院肺病科,瀘州 646000)

    肺癌在我國具有高發(fā)病率和高死亡率等特點,這一大難題長期困擾著臨床醫(yī)生。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌主要的類型,約占80%[1]。目前臨床上常用治療方法包括手術(shù)、放化療等,但其療效多數(shù)仍不盡人意,臨床治療失敗的主要原因為腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移。由于惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多因素、多途徑、多環(huán)節(jié)等過程,目前臨床上使用的單靶點藥物常常不能達到令人滿意的效果。中藥是藥用化合物的天然寶庫,同時也是發(fā)現(xiàn)新型活性化合物的重要途徑。許多報道證實,某些中藥成分具有促進細胞凋亡、激活自噬的活性[2-4]。蘆根常用于治肺熱咳嗽、肺癰吐膿、大葉性肺炎等[5-8]。調(diào)查顯示,許多經(jīng)典名方中均加入以蘆根為原料的中藥治療肺癌,可顯著抑制肺癌發(fā)展并改善肺功能[9-13]。其中,蘆根多糖具有多方面藥理活性,如提高機體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[14]。這些研究均提示蘆根多糖可能具有顯著的抗肺癌作用。然而,蘆根多糖是否對NSCLC具有顯著的抑制作用,有待深入研究。因此,本課題以前期研究為基礎(chǔ),通過體外及體內(nèi)模型,開展蘆根多糖對NSCLC抑制的作用及機制研究,為中藥蘆根抗肺癌活性的開發(fā)應(yīng)用奠定重要基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1細胞 A549細胞:NSCLC細胞系,來源于CCTCC武漢細胞庫。本實驗室長期傳代保存,采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2及相對濕度95%條件下常規(guī)培養(yǎng)。

    1.1.2動物 Balb/c裸鼠:無特定病原體(SPF)級,4~6周齡,雄鼠,體質(zhì)量16~20 g。購自成都達碩實驗動物有限公司。動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2013-24。飼養(yǎng)間溫度:25~26 ℃,飼養(yǎng)間濕度:55%~70%,12 h明暗交替,常規(guī)全價繁殖期飼料喂養(yǎng),自由飲水。

    1.1.3藥物與試劑 蘆根(四川省中藥飲片有限責任公司,批號:180528);蘆根多糖:由實驗室前期制備分離,提取率為1.64%,本實驗室4 ℃保存。順鉑(Cis-platinum,DDP),每瓶0.02 g,批號:1WA2A1311031B。RPIM 1640培養(yǎng)基(Gibco,批號:1848026);CCK-8細胞活力試劑盒(Dojindo,批號:GB707);AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,批號:C3062M);磷酸鹽緩沖溶液-PBS粉末(索萊寶生物科技有限公司,批號:P1010);二甲亞砜(Dimethyl suphoxide,DMSO,Sigma公司,批號:SHBH7843);Caspase-3抗體(美國abcam生物科技公司,批號:ab69482);PI 3 Kinase p110α Goat mAb(Cell Signal Technology,批號:4249);Phospho-PI 3 Kinase p85(Tyr458)/p55(Tyr199)Antibody(Cell Signal Technology,批號:4228);Akt Rabbit mAb(Cell Signal Technology,批號:4603);Phospho-Akt(Ser473)Rabbit mAb(Cell Signal Technology,批號:4080);Bcl-2(D 55G 8)Goat mAb(Cell Signal Technology,批號:4223);β-Actin(13E 5)Goat mAb(Cell Signal Technology,100 μL,批號:4970);Anti-Rabbit IgG(Cell Signal Technology,批號:4414)。

    1.1.4主要實驗設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo,USA,型號:LS-C 0150);潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,型號:SW-CJ-2FD);多模式微孔檢測儀(美國Bio-Tek,USA,型號:Cytation3);倒置相差熒光顯微鏡(日本Nikon,型號:TS 100);電子天平(美國OHAUS,型號:AR 2140,感量:0.01 mg);流式細胞儀(美國BD生物科技公司,型號:FACSVerse);移液器(德國Eppendorf系列,2.5~1000 μL);高速離心機(廣州科栢實驗器材有限公司,型號:lwicrfuge16)。

    1.2方法

    1.2.1工作液配制 蘆根多糖工作液:取40 mg蘆根多糖,加入1 mL PBS中配制濃度為40 mg·mL-1,臨用前用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至4,2,1,0.5,0.25 mg·mL-1,備用。順鉑工作液配制:取1瓶順鉑,每次給藥前取100 μL加2400 μL生理鹽水至2.5 mL。順鉑溶液配制在通風櫥中進行,配制后密封備用。

    1.2.2小鼠A549肺癌移植瘤模型建立 取對數(shù)生長期的A549細胞,胰蛋白酶消化及培養(yǎng)基終止消化后離心,磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸,調(diào)整細胞密度為1×107個·mL-1。將細胞懸液接種于裸鼠右側(cè)腋下,每只接種0.1 mL,7 d后瘤體形成,建立NSCLC A549移植瘤模型。A549細胞接種到裸鼠身上13 d后,若小鼠瘤體體積達到90 mm3,則表明A549裸鼠移植瘤模型成功。

    1.2.3蘆根多糖對A549細胞及在體肺癌移植瘤的抑制作用 將移植瘤模型小鼠隨機分為3組,即順鉑組(2 mg·kg-1,每2天腹腔注射1次,9次),蘆根多糖組(100 mg·kg-1,每天灌胃1次,連續(xù)給藥18 d)和對照組(與蘆根多糖組等體積的配制的蘆根多糖溶劑,每天灌胃1次,連續(xù)給藥18 d)。

    密切觀察小鼠造模前后及給藥前后的精神狀態(tài)、飲食、體質(zhì)量變化及死亡情況。分別于首次給藥后第3,6,9,12,15,18天測量腫瘤體積(V=1/2ab2,a表示腫瘤最長半徑,b表示腫瘤最短半徑),繪制腫瘤瘤體生長曲線圖。末次給藥后24 h處死,解剖取瘤,記錄瘤體質(zhì)量,剝?nèi)∧[瘤組織,并將其固定于10%甲醛溶液中,且剪取部分腫瘤組織凍存于液氮中。

    計算腫瘤抑制率:腫瘤抑制率(%)=(對照組腫瘤體積-藥物組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。

    1.2.4CCK-8檢測細胞活性 蘆根多糖處理A549細胞48 h后,將處于對數(shù)生長期細胞接種在96孔板中,濃度調(diào)整為5×104個·mL-1,加細胞懸液每孔100 μL,細胞貼壁后,每孔加CCK-8 10 μL,孵育2 h,450 nm處測吸光度值(A)。根據(jù)A值計算抑制率,抑制率(%)=(對照組A-藥物組A)/對照組A×100%。

    1.2.5流式檢測細胞凋亡 藥物干預(yù):以細胞密度為每孔4×105個接種于6孔板,每孔900 μL,設(shè)置蘆根多糖組、空白對照組,每組三個復孔。48 h后,蘆根多糖組加入蘆根多糖工作液(100 mg·mL-1,100 μL),空白對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL。

    流式檢測細胞凋亡:48 h后取出6孔板,棄去全部上清液,使用PBS液,清洗細胞2次。胰酶消化、離心、PBS重懸,調(diào)整細胞密度為1×106個·mL-1。按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書要求,取細胞懸液100 μL于EP管中,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,用槍頭輕輕混勻,室溫避光孵育15 min。隨后,將EP管中的全部液體轉(zhuǎn)移至流式檢測管中,再加入400 μL PBS,混勻,上機檢測。流式細胞結(jié)果按照不同象限區(qū)分,Q 1區(qū):PI(+)AnnexinV(-),代表機械性死亡細胞區(qū);Q2區(qū):PI(+)AnnexinV(+),代表晚期凋亡細胞區(qū);Q3區(qū):PI(-)AnnexinV(+),代表早期凋亡區(qū);Q4區(qū):PI(-)AnnexinV(-),代表活細胞區(qū)。

    1.2.6Western blotting檢測LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ,PI3K,p-PI3K,AKT及p-AKT蛋白表達水平 將細胞以密度為每孔4×105個接種于6孔板中,加入蘆根多糖工作液(100 mg·mL-1,100 μL),孵育48 h后,提取蛋白,測含量。跑膠、電泳1.5 h、轉(zhuǎn)膜 2.5 h、封閉1.5 h。一抗 4 ℃過夜,二抗孵育 2 h,顯色,凝膠圖像分析軟件對結(jié)果進行灰度分析。

    1.2.7免疫組化法檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達 腫瘤組織在10%甲醛溶液中固定12 h后,常規(guī)石蠟包埋切片,3%H2O2清除內(nèi)源性過氧化酶,并進行熱修復抗原;加入一抗(Bax,1:100;Bcl-2,1:250;Caspase-3,1:25稀釋),37 ℃ 孵育;加入HRP標記的二抗孵育;DAB 顯色,蘇木精復染;鏡檢。

    1.3統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理采用SPASS 21.0版統(tǒng)計軟件,結(jié)果用均數(shù)±標準差(x±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用 LSD 法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1不同濃度蘆根多糖對A549細胞活性的影響 根據(jù)抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導原則,抑制率大于30%認為藥物對腫瘤細胞較為敏感。將不同濃度蘆根多糖分別干預(yù)A549細胞24,48及72 h后,使用CCK-8試劑盒對細胞活力進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆根多糖在濃度100 μg·mL-1,干預(yù)48及72 h時,對A549細胞的增殖抑制率最佳,大于30%(P<0.05),見圖1。

    ①與對照組比較,P<0.05。

    2.2蘆根多糖顯著促進A549細胞凋亡 為進一步探討蘆根多糖對A549細胞增殖活性的抑制效應(yīng)是否與細胞凋亡相關(guān)。利用流式細胞技術(shù)檢測蘆根多糖干預(yù)后的A549細胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較,蘆根多糖組早期凋亡(Annexin-V+/PI-,Q3象限)和晚期凋亡(Annexin-V+/PI+,Q2象限)細胞的比例明顯升高(P<0.05),見圖2。提示蘆根多糖具有促進A549細胞凋亡的作用。

    2.3蘆根多糖促進A549細胞自噬 為進一步探討蘆根多糖抑制A549細胞增殖是否亦與激活細胞自噬有關(guān),利用western blot對自噬激活關(guān)鍵蛋白LC3以及自噬經(jīng)典信號通路PI3K-AKT相關(guān)蛋白進行檢測。LC3蛋白是一種自噬標記物,自噬激活后LC3-Ⅰ會通過酶解一小段多肽轉(zhuǎn)變成LC 3-Ⅱ,因此LC 3-Ⅱ/Ⅰ比例增加提示自噬激活[15]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,蘆根多糖組LC 3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯升高(P<0.01),表明A549細胞自噬被激活;盡管與對照組比較,蘆根多糖干預(yù)A549細胞后其AKT、PI3K總蛋白表達無顯著變化(P>0.05),但p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K比值顯著升高(P<0.01),結(jié)果見圖3。

    A.對照組;B.蘆根多糖組;C.A549細胞凋亡率;①與對照組比較,P<0.01。

    ①與對照組比較,P<0.01。

    2.4蘆根多糖對A549移植瘤裸鼠模型的體內(nèi)藥效學研究

    2.4.1一般性觀察 在小鼠腋下接種A549細胞,接種后7 d時肉眼可見腫瘤,到第13天時腫瘤體積達90 mm3,成功率90.0%。移植瘤模型建立后小鼠精神萎靡,食欲不振,活動減少,體質(zhì)量下降。

    2.4.2蘆根多糖對A549移植瘤小鼠腫瘤體積及質(zhì)量的影響 移植瘤模型建成后,予以小鼠蘆根多糖治療,觀察其對小鼠腫瘤的影響。與對照組比較,給藥后第9天開始,藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)能明顯抑制小鼠腫瘤體積的生長(圖4),其中順鉑與蘆根多糖組腫瘤生長曲線相似,提示蘆根多糖與順鉑對腫瘤生長具有相似的抑制效果。給藥第18天后,與對照組比較,藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)腫瘤質(zhì)量低于對照組,順鉑和蘆根多糖對小鼠腫瘤的抑制率分別為39.1%,35.9%(表1)。

    表1 蘆根多糖對A549移植瘤裸鼠腫瘤的抑制率

    2.4.3蘆根多糖對A549移植瘤小鼠臟器指數(shù)的影響 臟器指數(shù)是動物臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量之比,主要反映藥物對機體的毒性。與對照組比較,藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)小鼠的肝臟及脾臟指數(shù)無明顯變化(表2)。

    ①與對照組比較,P<0.01。

    表2 蘆根多糖對A549移植瘤小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響

    2.5蘆根多糖對A549移植瘤小鼠Bax、Bcl-2和Caspase-3表達的影響 利用免疫組化染色檢測蘆根多糖治療后對A549移植瘤小鼠腫瘤組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3表達的影響,與對照組比較,藥物治療組(順鉑、蘆根多糖)能明顯抑制Bcl-2的表達(P<0.05);相反,藥物治療組能顯著促進Bax、Caspase-3的表達(P<0.05),見圖5。

    3 討論

    近年來研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)經(jīng)典名方對肺癌有一定的抗癌作用,其中蘆根多糖具有提高機體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多重功效[14],但其是否亦可抑制NSCLC的增殖仍不清楚。因此,本研究通過動物和離體細胞實驗探討了蘆根多糖對A549細胞及其移植瘤小鼠模型的治療效應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆根多糖可通過促進細胞凋亡和增強細胞自噬進而抑制A549細胞的增殖和小鼠腫瘤的生長。

    考慮到A549細胞株來源于臨床患者肺腫瘤組織[16],較為符合臨床特征,而且曾經(jīng)廣泛用于治療肺癌藥物開發(fā)(如紫杉醇、多烯紫杉醇、貝伐單抗等),受到行業(yè)認可。因此,A549細胞成為肺癌藥物開發(fā)過程中的一種經(jīng)典的篩選模型。為此,本研究利用A549細胞株建立NSCLC的體外、體內(nèi)模型,用于評價和探究蘆根多糖抑制NSCLC的藥效作用及其分子機制。此外,臨床證據(jù)表明順鉑聯(lián)合放療對晚期NSCLC具有良好的治療作用[17],成為化療藥物中鉑類制劑的首選。因此,選擇順鉑作為NSCLC移植瘤模型的陽性對照藥物。

    ①與對照組比較,P<0.05;②與對照組比較,P< 0.01。

    蘆根味甘,性寒,入肺經(jīng),善清透肺熱,常用于治肺熱咳嗽、肺癰吐膿、大葉性肺炎等,在中醫(yī)治療肺癌的諸方、民間驗方中均有應(yīng)用。蘆根中糖類成分的含量較高,約含51%多糖,前期研究表明蘆根多糖具有抗Hela腫瘤細胞及B16細胞活性[18],提示蘆根多糖可能對肺癌也具有一定的治療作用。鑒于細胞凋亡和自噬在腫瘤細胞增殖中具有重要作用[19],筆者在明確了蘆根多糖可顯著抑制A549細胞及移植瘤小鼠腫瘤的增殖基礎(chǔ)上,進一步探討了其發(fā)揮抑制效應(yīng)的潛在機制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆根多糖可上調(diào)A549細胞移植瘤小鼠腫瘤組織促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白表達,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達。提示蘆根多糖可能促進A549細胞產(chǎn)生細胞凋亡效應(yīng),抑制移植瘤小鼠A549腫瘤組織形成。此外,還發(fā)現(xiàn)蘆根多糖干預(yù)治療后可顯著增加LC-3Ⅱ/Ⅰ比例,且AKT、PI3K磷酸化水平增加,表明蘆根多糖可激活細胞自噬,抑制A549細胞增殖,進而顯著抑制A549細胞移植瘤小鼠的腫瘤生長。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)蘆根多糖對A549細胞移植瘤小鼠肝臟、脾臟功能無明顯影響,表明蘆根多糖具備潛在的抗癌藥物特性。

    綜上所述,蘆根多糖可能通過促進腫瘤細胞凋亡和自噬,抑制NSCLC A549細胞增殖,為其作為一種潛在的NSCLC候選治療藥物。

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