• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蘆根多糖誘導(dǎo)自噬和凋亡抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖

    2020-08-10 01:56:56鄧小娟敖素華
    醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2020年8期
    關(guān)鍵詞:肺癌小鼠

    鄧小娟,敖素華

    (1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院門診部,成都 610072;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肺病科,瀘州 646000)

    肺癌在我國具有高發(fā)病率和高死亡率等特點(diǎn),這一大難題長期困擾著臨床醫(yī)生。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌主要的類型,約占80%[1]。目前臨床上常用治療方法包括手術(shù)、放化療等,但其療效多數(shù)仍不盡人意,臨床治療失敗的主要原因?yàn)槟[瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。由于惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多因素、多途徑、多環(huán)節(jié)等過程,目前臨床上使用的單靶點(diǎn)藥物常常不能達(dá)到令人滿意的效果。中藥是藥用化合物的天然寶庫,同時(shí)也是發(fā)現(xiàn)新型活性化合物的重要途徑。許多報(bào)道證實(shí),某些中藥成分具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、激活自噬的活性[2-4]。蘆根常用于治肺熱咳嗽、肺癰吐膿、大葉性肺炎等[5-8]。調(diào)查顯示,許多經(jīng)典名方中均加入以蘆根為原料的中藥治療肺癌,可顯著抑制肺癌發(fā)展并改善肺功能[9-13]。其中,蘆根多糖具有多方面藥理活性,如提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[14]。這些研究均提示蘆根多糖可能具有顯著的抗肺癌作用。然而,蘆根多糖是否對(duì)NSCLC具有顯著的抑制作用,有待深入研究。因此,本課題以前期研究為基礎(chǔ),通過體外及體內(nèi)模型,開展蘆根多糖對(duì)NSCLC抑制的作用及機(jī)制研究,為中藥蘆根抗肺癌活性的開發(fā)應(yīng)用奠定重要基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1細(xì)胞 A549細(xì)胞:NSCLC細(xì)胞系,來源于CCTCC武漢細(xì)胞庫。本實(shí)驗(yàn)室長期傳代保存,采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2及相對(duì)濕度95%條件下常規(guī)培養(yǎng)。

    1.1.2動(dòng)物 Balb/c裸鼠:無特定病原體(SPF)級(jí),4~6周齡,雄鼠,體質(zhì)量16~20 g。購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(川)2013-24。飼養(yǎng)間溫度:25~26 ℃,飼養(yǎng)間濕度:55%~70%,12 h明暗交替,常規(guī)全價(jià)繁殖期飼料喂養(yǎng),自由飲水。

    1.1.3藥物與試劑 蘆根(四川省中藥飲片有限責(zé)任公司,批號(hào):180528);蘆根多糖:由實(shí)驗(yàn)室前期制備分離,提取率為1.64%,本實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存。順鉑(Cis-platinum,DDP),每瓶0.02 g,批號(hào):1WA2A1311031B。RPIM 1640培養(yǎng)基(Gibco,批號(hào):1848026);CCK-8細(xì)胞活力試劑盒(Dojindo,批號(hào):GB707);AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):C3062M);磷酸鹽緩沖溶液-PBS粉末(索萊寶生物科技有限公司,批號(hào):P1010);二甲亞砜(Dimethyl suphoxide,DMSO,Sigma公司,批號(hào):SHBH7843);Caspase-3抗體(美國abcam生物科技公司,批號(hào):ab69482);PI 3 Kinase p110α Goat mAb(Cell Signal Technology,批號(hào):4249);Phospho-PI 3 Kinase p85(Tyr458)/p55(Tyr199)Antibody(Cell Signal Technology,批號(hào):4228);Akt Rabbit mAb(Cell Signal Technology,批號(hào):4603);Phospho-Akt(Ser473)Rabbit mAb(Cell Signal Technology,批號(hào):4080);Bcl-2(D 55G 8)Goat mAb(Cell Signal Technology,批號(hào):4223);β-Actin(13E 5)Goat mAb(Cell Signal Technology,100 μL,批號(hào):4970);Anti-Rabbit IgG(Cell Signal Technology,批號(hào):4414)。

    1.1.4主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo,USA,型號(hào):LS-C 0150);潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,型號(hào):SW-CJ-2FD);多模式微孔檢測(cè)儀(美國Bio-Tek,USA,型號(hào):Cytation3);倒置相差熒光顯微鏡(日本Nikon,型號(hào):TS 100);電子天平(美國OHAUS,型號(hào):AR 2140,感量:0.01 mg);流式細(xì)胞儀(美國BD生物科技公司,型號(hào):FACSVerse);移液器(德國Eppendorf系列,2.5~1000 μL);高速離心機(jī)(廣州科栢實(shí)驗(yàn)器材有限公司,型號(hào):lwicrfuge16)。

    1.2方法

    1.2.1工作液配制 蘆根多糖工作液:取40 mg蘆根多糖,加入1 mL PBS中配制濃度為40 mg·mL-1,臨用前用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至4,2,1,0.5,0.25 mg·mL-1,備用。順鉑工作液配制:取1瓶順鉑,每次給藥前取100 μL加2400 μL生理鹽水至2.5 mL。順鉑溶液配制在通風(fēng)櫥中進(jìn)行,配制后密封備用。

    1.2.2小鼠A549肺癌移植瘤模型建立 取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞,胰蛋白酶消化及培養(yǎng)基終止消化后離心,磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)·mL-1。將細(xì)胞懸液接種于裸鼠右側(cè)腋下,每只接種0.1 mL,7 d后瘤體形成,建立NSCLC A549移植瘤模型。A549細(xì)胞接種到裸鼠身上13 d后,若小鼠瘤體體積達(dá)到90 mm3,則表明A549裸鼠移植瘤模型成功。

    1.2.3蘆根多糖對(duì)A549細(xì)胞及在體肺癌移植瘤的抑制作用 將移植瘤模型小鼠隨機(jī)分為3組,即順鉑組(2 mg·kg-1,每2天腹腔注射1次,9次),蘆根多糖組(100 mg·kg-1,每天灌胃1次,連續(xù)給藥18 d)和對(duì)照組(與蘆根多糖組等體積的配制的蘆根多糖溶劑,每天灌胃1次,連續(xù)給藥18 d)。

    密切觀察小鼠造模前后及給藥前后的精神狀態(tài)、飲食、體質(zhì)量變化及死亡情況。分別于首次給藥后第3,6,9,12,15,18天測(cè)量腫瘤體積(V=1/2ab2,a表示腫瘤最長半徑,b表示腫瘤最短半徑),繪制腫瘤瘤體生長曲線圖。末次給藥后24 h處死,解剖取瘤,記錄瘤體質(zhì)量,剝?nèi)∧[瘤組織,并將其固定于10%甲醛溶液中,且剪取部分腫瘤組織凍存于液氮中。

    計(jì)算腫瘤抑制率:腫瘤抑制率(%)=(對(duì)照組腫瘤體積-藥物組腫瘤體積)/對(duì)照組腫瘤體積×100%。

    1.2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 蘆根多糖處理A549細(xì)胞48 h后,將處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種在96孔板中,濃度調(diào)整為5×104個(gè)·mL-1,加細(xì)胞懸液每孔100 μL,細(xì)胞貼壁后,每孔加CCK-8 10 μL,孵育2 h,450 nm處測(cè)吸光度值(A)。根據(jù)A值計(jì)算抑制率,抑制率(%)=(對(duì)照組A-藥物組A)/對(duì)照組A×100%。

    1.2.5流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 藥物干預(yù):以細(xì)胞密度為每孔4×105個(gè)接種于6孔板,每孔900 μL,設(shè)置蘆根多糖組、空白對(duì)照組,每組三個(gè)復(fù)孔。48 h后,蘆根多糖組加入蘆根多糖工作液(100 mg·mL-1,100 μL),空白對(duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL。

    流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡:48 h后取出6孔板,棄去全部上清液,使用PBS液,清洗細(xì)胞2次。胰酶消化、離心、PBS重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)·mL-1。按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書要求,取細(xì)胞懸液100 μL于EP管中,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,用槍頭輕輕混勻,室溫避光孵育15 min。隨后,將EP管中的全部液體轉(zhuǎn)移至流式檢測(cè)管中,再加入400 μL PBS,混勻,上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞結(jié)果按照不同象限區(qū)分,Q 1區(qū):PI(+)AnnexinV(-),代表機(jī)械性死亡細(xì)胞區(qū);Q2區(qū):PI(+)AnnexinV(+),代表晚期凋亡細(xì)胞區(qū);Q3區(qū):PI(-)AnnexinV(+),代表早期凋亡區(qū);Q4區(qū):PI(-)AnnexinV(-),代表活細(xì)胞區(qū)。

    1.2.6Western blotting檢測(cè)LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ,PI3K,p-PI3K,AKT及p-AKT蛋白表達(dá)水平 將細(xì)胞以密度為每孔4×105個(gè)接種于6孔板中,加入蘆根多糖工作液(100 mg·mL-1,100 μL),孵育48 h后,提取蛋白,測(cè)含量。跑膠、電泳1.5 h、轉(zhuǎn)膜 2.5 h、封閉1.5 h。一抗 4 ℃過夜,二抗孵育 2 h,顯色,凝膠圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

    1.2.7免疫組化法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá) 腫瘤組織在10%甲醛溶液中固定12 h后,常規(guī)石蠟包埋切片,3%H2O2清除內(nèi)源性過氧化酶,并進(jìn)行熱修復(fù)抗原;加入一抗(Bax,1:100;Bcl-2,1:250;Caspase-3,1:25稀釋),37 ℃ 孵育;加入HRP標(biāo)記的二抗孵育;DAB 顯色,蘇木精復(fù)染;鏡檢。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPASS 21.0版統(tǒng)計(jì)軟件,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用 LSD 法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1不同濃度蘆根多糖對(duì)A549細(xì)胞活性的影響 根據(jù)抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則,抑制率大于30%認(rèn)為藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞較為敏感。將不同濃度蘆根多糖分別干預(yù)A549細(xì)胞24,48及72 h后,使用CCK-8試劑盒對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆根多糖在濃度100 μg·mL-1,干預(yù)48及72 h時(shí),對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率最佳,大于30%(P<0.05),見圖1。

    ①與對(duì)照組比較,P<0.05。

    2.2蘆根多糖顯著促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡 為進(jìn)一步探討蘆根多糖對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的抑制效應(yīng)是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)。利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)蘆根多糖干預(yù)后的A549細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較,蘆根多糖組早期凋亡(Annexin-V+/PI-,Q3象限)和晚期凋亡(Annexin-V+/PI+,Q2象限)細(xì)胞的比例明顯升高(P<0.05),見圖2。提示蘆根多糖具有促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的作用。

    2.3蘆根多糖促進(jìn)A549細(xì)胞自噬 為進(jìn)一步探討蘆根多糖抑制A549細(xì)胞增殖是否亦與激活細(xì)胞自噬有關(guān),利用western blot對(duì)自噬激活關(guān)鍵蛋白LC3以及自噬經(jīng)典信號(hào)通路PI3K-AKT相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。LC3蛋白是一種自噬標(biāo)記物,自噬激活后LC3-Ⅰ會(huì)通過酶解一小段多肽轉(zhuǎn)變成LC 3-Ⅱ,因此LC 3-Ⅱ/Ⅰ比例增加提示自噬激活[15]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,蘆根多糖組LC 3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯升高(P<0.01),表明A549細(xì)胞自噬被激活;盡管與對(duì)照組比較,蘆根多糖干預(yù)A549細(xì)胞后其AKT、PI3K總蛋白表達(dá)無顯著變化(P>0.05),但p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K比值顯著升高(P<0.01),結(jié)果見圖3。

    A.對(duì)照組;B.蘆根多糖組;C.A549細(xì)胞凋亡率;①與對(duì)照組比較,P<0.01。

    ①與對(duì)照組比較,P<0.01。

    2.4蘆根多糖對(duì)A549移植瘤裸鼠模型的體內(nèi)藥效學(xué)研究

    2.4.1一般性觀察 在小鼠腋下接種A549細(xì)胞,接種后7 d時(shí)肉眼可見腫瘤,到第13天時(shí)腫瘤體積達(dá)90 mm3,成功率90.0%。移植瘤模型建立后小鼠精神萎靡,食欲不振,活動(dòng)減少,體質(zhì)量下降。

    2.4.2蘆根多糖對(duì)A549移植瘤小鼠腫瘤體積及質(zhì)量的影響 移植瘤模型建成后,予以小鼠蘆根多糖治療,觀察其對(duì)小鼠腫瘤的影響。與對(duì)照組比較,給藥后第9天開始,藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)能明顯抑制小鼠腫瘤體積的生長(圖4),其中順鉑與蘆根多糖組腫瘤生長曲線相似,提示蘆根多糖與順鉑對(duì)腫瘤生長具有相似的抑制效果。給藥第18天后,與對(duì)照組比較,藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)腫瘤質(zhì)量低于對(duì)照組,順鉑和蘆根多糖對(duì)小鼠腫瘤的抑制率分別為39.1%,35.9%(表1)。

    表1 蘆根多糖對(duì)A549移植瘤裸鼠腫瘤的抑制率

    2.4.3蘆根多糖對(duì)A549移植瘤小鼠臟器指數(shù)的影響 臟器指數(shù)是動(dòng)物臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量之比,主要反映藥物對(duì)機(jī)體的毒性。與對(duì)照組比較,藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)小鼠的肝臟及脾臟指數(shù)無明顯變化(表2)。

    ①與對(duì)照組比較,P<0.01。

    表2 蘆根多糖對(duì)A549移植瘤小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響

    2.5蘆根多糖對(duì)A549移植瘤小鼠Bax、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響 利用免疫組化染色檢測(cè)蘆根多糖治療后對(duì)A549移植瘤小鼠腫瘤組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響,與對(duì)照組比較,藥物治療組(順鉑、蘆根多糖)能明顯抑制Bcl-2的表達(dá)(P<0.05);相反,藥物治療組能顯著促進(jìn)Bax、Caspase-3的表達(dá)(P<0.05),見圖5。

    3 討論

    近年來研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)經(jīng)典名方對(duì)肺癌有一定的抗癌作用,其中蘆根多糖具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多重功效[14],但其是否亦可抑制NSCLC的增殖仍不清楚。因此,本研究通過動(dòng)物和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討了蘆根多糖對(duì)A549細(xì)胞及其移植瘤小鼠模型的治療效應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆根多糖可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)細(xì)胞自噬進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的增殖和小鼠腫瘤的生長。

    考慮到A549細(xì)胞株來源于臨床患者肺腫瘤組織[16],較為符合臨床特征,而且曾經(jīng)廣泛用于治療肺癌藥物開發(fā)(如紫杉醇、多烯紫杉醇、貝伐單抗等),受到行業(yè)認(rèn)可。因此,A549細(xì)胞成為肺癌藥物開發(fā)過程中的一種經(jīng)典的篩選模型。為此,本研究利用A549細(xì)胞株建立NSCLC的體外、體內(nèi)模型,用于評(píng)價(jià)和探究蘆根多糖抑制NSCLC的藥效作用及其分子機(jī)制。此外,臨床證據(jù)表明順鉑聯(lián)合放療對(duì)晚期NSCLC具有良好的治療作用[17],成為化療藥物中鉑類制劑的首選。因此,選擇順鉑作為NSCLC移植瘤模型的陽性對(duì)照藥物。

    ①與對(duì)照組比較,P<0.05;②與對(duì)照組比較,P< 0.01。

    蘆根味甘,性寒,入肺經(jīng),善清透肺熱,常用于治肺熱咳嗽、肺癰吐膿、大葉性肺炎等,在中醫(yī)治療肺癌的諸方、民間驗(yàn)方中均有應(yīng)用。蘆根中糖類成分的含量較高,約含51%多糖,前期研究表明蘆根多糖具有抗Hela腫瘤細(xì)胞及B16細(xì)胞活性[18],提示蘆根多糖可能對(duì)肺癌也具有一定的治療作用。鑒于細(xì)胞凋亡和自噬在腫瘤細(xì)胞增殖中具有重要作用[19],筆者在明確了蘆根多糖可顯著抑制A549細(xì)胞及移植瘤小鼠腫瘤的增殖基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了其發(fā)揮抑制效應(yīng)的潛在機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆根多糖可上調(diào)A549細(xì)胞移植瘤小鼠腫瘤組織促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白表達(dá),下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)。提示蘆根多糖可能促進(jìn)A549細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡效應(yīng),抑制移植瘤小鼠A549腫瘤組織形成。此外,還發(fā)現(xiàn)蘆根多糖干預(yù)治療后可顯著增加LC-3Ⅱ/Ⅰ比例,且AKT、PI3K磷酸化水平增加,表明蘆根多糖可激活細(xì)胞自噬,抑制A549細(xì)胞增殖,進(jìn)而顯著抑制A549細(xì)胞移植瘤小鼠的腫瘤生長。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘆根多糖對(duì)A549細(xì)胞移植瘤小鼠肝臟、脾臟功能無明顯影響,表明蘆根多糖具備潛在的抗癌藥物特性。

    綜上所述,蘆根多糖可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬,抑制NSCLC A549細(xì)胞增殖,為其作為一種潛在的NSCLC候選治療藥物。

    猜你喜歡
    肺癌小鼠
    中醫(yī)防治肺癌術(shù)后并發(fā)癥
    對(duì)比增強(qiáng)磁敏感加權(quán)成像對(duì)肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤檢出的研究
    小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
    米小鼠和它的伙伴們
    PFTK1在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義
    Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
    microRNA-205在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義
    基于肺癌CT的決策樹模型在肺癌診斷中的應(yīng)用
    加味四逆湯對(duì)Con A肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
    營救小鼠(5)
    国产99白浆流出| 日本黄色视频三级网站网址| 老司机深夜福利视频在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 久久香蕉精品热| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲专区中文字幕在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 我要搜黄色片| 午夜福利成人在线免费观看| 精品福利观看| 久久亚洲精品不卡| 国产成人精品无人区| 国产单亲对白刺激| www日本在线高清视频| 日本五十路高清| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 99精品久久久久人妻精品| 真实男女啪啪啪动态图| 99视频精品全部免费 在线 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 中文字幕高清在线视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 久99久视频精品免费| 亚洲欧美日韩高清在线视频| av在线蜜桃| 久久久久久久久久黄片| 亚洲国产色片| 99热精品在线国产| 成人国产一区最新在线观看| av在线天堂中文字幕| 国内精品久久久久久久电影| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品国产乱码久久久久久男人| 国内精品久久久久久久电影| 不卡av一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 久久久精品欧美日韩精品| 精品无人区乱码1区二区| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲18禁久久av| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久香蕉国产精品| av片东京热男人的天堂| 国产精品国产高清国产av| 五月伊人婷婷丁香| 中国美女看黄片| 国产精品永久免费网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 岛国视频午夜一区免费看| a级毛片在线看网站| 久久伊人香网站| 国产精品99久久99久久久不卡| 一区福利在线观看| 免费观看的影片在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 国产99白浆流出| 久久精品影院6| 在线观看日韩欧美| 99久久99久久久精品蜜桃| 成人国产一区最新在线观看| 久久中文字幕一级| 女人被狂操c到高潮| 搞女人的毛片| 丁香欧美五月| 91在线精品国自产拍蜜月 | 老司机深夜福利视频在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 一夜夜www| 久久草成人影院| 国内精品一区二区在线观看| 日韩欧美三级三区| 国产成人aa在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品人妻1区二区| 香蕉丝袜av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 精品不卡国产一区二区三区| 国产高清视频在线观看网站| aaaaa片日本免费| 一本综合久久免费| 国产不卡一卡二| 中亚洲国语对白在线视频| 中文字幕最新亚洲高清| 黄色 视频免费看| 国产三级黄色录像| 色综合欧美亚洲国产小说| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产成+人综合+亚洲专区| 一级a爱片免费观看的视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美日本视频| 一区福利在线观看| 香蕉国产在线看| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精华国产精华精| 观看免费一级毛片| 日本五十路高清| 国产高清有码在线观看视频| 黄色丝袜av网址大全| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 母亲3免费完整高清在线观看| 在线观看日韩欧美| 人妻久久中文字幕网| 窝窝影院91人妻| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产午夜精品久久久久久| 免费搜索国产男女视频| 精品无人区乱码1区二区| 久久久精品大字幕| 亚洲色图av天堂| 97碰自拍视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日韩av在线大香蕉| 久久性视频一级片| 精品久久久久久成人av| 成人永久免费在线观看视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 十八禁网站免费在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 黄色日韩在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 麻豆成人av在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 很黄的视频免费| 欧美精品啪啪一区二区三区| 在线永久观看黄色视频| 日韩有码中文字幕| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲18禁久久av| 免费在线观看亚洲国产| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品九九99| 美女高潮的动态| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品爽爽va在线观看网站| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲专区中文字幕在线| 日本 欧美在线| 一级毛片女人18水好多| 欧美在线黄色| 俺也久久电影网| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产成人系列免费观看| av女优亚洲男人天堂 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 色综合欧美亚洲国产小说| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲av熟女| 中文字幕最新亚洲高清| 午夜福利在线在线| 中文字幕熟女人妻在线| 精品久久蜜臀av无| 国产极品精品免费视频能看的| 美女免费视频网站| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| bbb黄色大片| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久久久国产a免费观看| 婷婷丁香在线五月| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲av第一区精品v没综合| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 天堂动漫精品| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产午夜精品久久久久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产一区二区三区视频了| 香蕉丝袜av| 久久人妻av系列| 亚洲精品在线观看二区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 露出奶头的视频| 久久伊人香网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 日本一本二区三区精品| 久久亚洲精品不卡| 首页视频小说图片口味搜索| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 制服丝袜大香蕉在线| 国产综合懂色| 成人av一区二区三区在线看| 国产av不卡久久| 久99久视频精品免费| 成人欧美大片| 黄色 视频免费看| 日韩欧美三级三区| 亚洲五月婷婷丁香| www.熟女人妻精品国产| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品av视频在线免费观看| 国产高清有码在线观看视频| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲av五月六月丁香网| 黄色女人牲交| 午夜免费激情av| 久久久精品大字幕| 又粗又爽又猛毛片免费看| 90打野战视频偷拍视频| 国产97色在线日韩免费| 日本熟妇午夜| 99热只有精品国产| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 男女床上黄色一级片免费看| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久午夜亚洲精品久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 99久久精品一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 听说在线观看完整版免费高清| 又爽又黄无遮挡网站| 激情在线观看视频在线高清| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲五月婷婷丁香| 怎么达到女性高潮| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 精品无人区乱码1区二区| 搞女人的毛片| 精品国产三级普通话版| 国产精华一区二区三区| 99热这里只有是精品50| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产黄色小视频在线观看| 国产高清三级在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 不卡一级毛片| a在线观看视频网站| 一个人看视频在线观看www免费 | 成年免费大片在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 成人午夜高清在线视频| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产三级在线视频| bbb黄色大片| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 91九色精品人成在线观看| 亚洲18禁久久av| svipshipincom国产片| 久久久国产欧美日韩av| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久人人人人人| 成年人黄色毛片网站| 老司机在亚洲福利影院| av视频在线观看入口| 9191精品国产免费久久| 欧美一区二区国产精品久久精品| 午夜精品一区二区三区免费看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 99久久精品国产亚洲精品| 国产高潮美女av| 午夜免费激情av| 国产乱人伦免费视频| 欧美日韩乱码在线| 特级一级黄色大片| 露出奶头的视频| 中文字幕久久专区| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 午夜免费观看网址| 高清在线国产一区| 他把我摸到了高潮在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| www日本黄色视频网| 久久久久性生活片| av中文乱码字幕在线| 一级作爱视频免费观看| 免费在线观看影片大全网站| 精品欧美国产一区二区三| 婷婷精品国产亚洲av| av视频在线观看入口| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美一区二区国产精品久久精品| 麻豆一二三区av精品| 国产成年人精品一区二区| 级片在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 级片在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲精品在线观看二区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日韩免费av在线播放| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 成人午夜高清在线视频| 曰老女人黄片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 成年版毛片免费区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美日韩精品网址| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品一区二区精品视频观看| 麻豆av在线久日| 网址你懂的国产日韩在线| 久久这里只有精品中国| 老司机午夜福利在线观看视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美黄色淫秽网站| 美女大奶头视频| 久久久国产成人精品二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 在线看三级毛片| 男人舔女人的私密视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲精品在线美女| 亚洲成av人片免费观看| 黄色 视频免费看| 精品欧美国产一区二区三| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲国产精品999在线| 色视频www国产| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久这里只有精品19| 欧美+亚洲+日韩+国产| 两性夫妻黄色片| 熟女电影av网| 美女cb高潮喷水在线观看 | 女警被强在线播放| 久久久久亚洲av毛片大全| 午夜激情福利司机影院| 久久人人精品亚洲av| 日本黄色片子视频| av国产免费在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲乱码一区二区免费版| 夜夜夜夜夜久久久久| 男女午夜视频在线观看| 91麻豆av在线| 久久亚洲精品不卡| 欧美大码av| 精品乱码久久久久久99久播| 国产人伦9x9x在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 99久久精品一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 韩国av一区二区三区四区| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月 | 国产高清激情床上av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 99re在线观看精品视频| 99久久成人亚洲精品观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产高清三级在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日日夜夜操网爽| 亚洲中文av在线| 真人做人爱边吃奶动态| 最近视频中文字幕2019在线8| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 舔av片在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 黄色视频,在线免费观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美午夜高清在线| 亚洲在线观看片| 热99在线观看视频| 久久久国产成人精品二区| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9 | netflix在线观看网站| 亚洲九九香蕉| 成年版毛片免费区| 午夜福利视频1000在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美日韩福利视频一区二区| av中文乱码字幕在线| 国产成人欧美在线观看| 午夜福利欧美成人| 很黄的视频免费| 日本黄大片高清| 一夜夜www| 丁香六月欧美| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美色视频一区免费| 白带黄色成豆腐渣| or卡值多少钱| 亚洲av成人精品一区久久| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品久久视频播放| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| av视频在线观看入口| 91在线观看av| 国产一区二区激情短视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美精品啪啪一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 日韩欧美 国产精品| 在线免费观看不下载黄p国产 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | avwww免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 嫁个100分男人电影在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲人与动物交配视频| 国产成人系列免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精华国产精华精| 又黄又爽又免费观看的视频| 日韩欧美免费精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 天堂影院成人在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 首页视频小说图片口味搜索| 午夜福利在线在线| e午夜精品久久久久久久| 亚洲自拍偷在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| av天堂在线播放| xxxwww97欧美| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 中国美女看黄片| 激情在线观看视频在线高清| 免费搜索国产男女视频| av在线蜜桃| e午夜精品久久久久久久| av欧美777| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美黑人欧美精品刺激| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产主播在线观看一区二区| 国产激情欧美一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 午夜两性在线视频| aaaaa片日本免费| 国产主播在线观看一区二区| 丁香六月欧美| 69av精品久久久久久| 日本黄大片高清| 美女高潮的动态| 香蕉av资源在线| 国产精品野战在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 麻豆久久精品国产亚洲av| 女人被狂操c到高潮| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品精品国产色婷婷| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美在线黄色| 99热精品在线国产| 成人午夜高清在线视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 色综合欧美亚洲国产小说| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产伦在线观看视频一区| a在线观看视频网站| 午夜免费成人在线视频| www.熟女人妻精品国产| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产成人av教育| 亚洲片人在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久伊人香网站| 国产黄a三级三级三级人| 日本熟妇午夜| 后天国语完整版免费观看| 国产成人系列免费观看| 怎么达到女性高潮| av视频在线观看入口| 国产高潮美女av| 成熟少妇高潮喷水视频| 麻豆国产97在线/欧美| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一本一本综合久久| av国产免费在线观看| 免费观看精品视频网站| 欧美zozozo另类| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国内精品一区二区在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 国产高清激情床上av| 中文字幕高清在线视频| 久久久久国内视频| 亚洲美女黄片视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲av第一区精品v没综合| 黄色 视频免费看| 欧美极品一区二区三区四区| 哪里可以看免费的av片| 欧美激情久久久久久爽电影| 一级作爱视频免费观看| 热99在线观看视频| 亚洲成av人片在线播放无| 午夜免费激情av| 在线视频色国产色| 脱女人内裤的视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲avbb在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产视频内射| 国产成年人精品一区二区| 亚洲成av人片在线播放无| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 99国产精品一区二区蜜桃av| 嫩草影视91久久| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲九九香蕉| 亚洲成人久久性| svipshipincom国产片| 嫩草影院精品99| 999久久久精品免费观看国产| 欧美成人免费av一区二区三区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| av黄色大香蕉| 性色av乱码一区二区三区2| 久久久久久人人人人人| 在线播放国产精品三级| 免费看美女性在线毛片视频| 国内精品美女久久久久久| 午夜福利成人在线免费观看| 90打野战视频偷拍视频| 精品国产亚洲在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产一区二区激情短视频| 国产视频一区二区在线看| 免费看日本二区| 久久久久久久午夜电影| 国产精品亚洲一级av第二区| av片东京热男人的天堂| 91麻豆精品激情在线观看国产| 99国产精品一区二区三区| 久久性视频一级片| 欧美一区二区精品小视频在线| 少妇的丰满在线观看| 国产成人福利小说| 国产黄片美女视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 丁香欧美五月| 91老司机精品| cao死你这个sao货| 最好的美女福利视频网| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久精品91无色码中文字幕| 成人三级黄色视频| 一区二区三区国产精品乱码| 国产亚洲精品久久久com|