青莢葉多糖的提取及含量測(cè)定

李雙妹

（濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 石油化工與環(huán)境工程系，河南 濮陽 457001）

青莢葉多糖的提取及含量測(cè)定

李雙妹

（濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 石油化工與環(huán)境工程系，河南 濮陽 457001）

為了開發(fā)青莢葉資源，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量，測(cè)得多糖的含量為274.3μg/g。苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確。青莢葉中含有較豐富的多糖，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

多糖；苯酚-硫酸法；青莢葉

0 引 言

青莢葉（Helwingia japonica）為茱萸科青莢葉屬，又稱葉上珠、葉上花，甘南州群眾俗稱葉里開花，又名大部參、陰證藥、葉長(zhǎng)花，因花著生于葉上面的中脈(近于基部)而得名。苗族藥名槍墻葉，多生于林下陰處，分布于貴州中西部各苗鄉(xiāng)。根莖葉入藥，具有舒筋活絡(luò)、調(diào)經(jīng)、清熱除濕、解毒消腫、涼血止血、清肺止咳等功效，并具有清熱利尿、下乳等功能。苗族民間常以葉上花、無花果、月季花搭配治療月經(jīng)不調(diào)，以葉上花、矮陀陀、土三七搭配治療勞傷，單用葉上花來治療年久咳喘[1]。由于青莢葉中含有肉桂酸和西米杜鵑醇等有機(jī)成分，因而可用于提取肉桂酸，用來合成治療冠心病的重要藥物，還可用做合成保鮮劑等[1]。因此，在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)有著廣泛的用途,是一種極其豐富而寶貴的自然資源。

多糖作為藥用始于20世紀(jì)40年代，近年來多糖類物質(zhì)是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。我國(guó)學(xué)者王開發(fā)等對(duì)5種植物的多糖進(jìn)行提取和研究認(rèn)為，多糖不但能治療機(jī)體的免疫缺陷疾病，還能治療諸如風(fēng)濕之類的自身免疫性疾病，并且具有抗氧化及抗衰老作用[2]。但對(duì)青莢葉多糖的研究還鮮有報(bào)道，因而對(duì)青莢葉多糖的研究具有重要的科學(xué)價(jià)值。青莢葉中含有豐富的多糖，運(yùn)用改進(jìn)的苯酚-硫酸法測(cè)定青莢葉多糖的含量，可以為進(jìn)一步合理開發(fā)青莢葉資源提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品來源及前期處理

青莢葉于2009年6月采自三門峽市盧氏縣。用萬能植物粉碎機(jī)將自然晾干的青莢葉粉碎成粉末狀，過40目篩。青莢葉中脂肪含量未知，脂肪的存在會(huì)影響其多糖的分析，應(yīng)先將青莢葉中的脂肪提取出來，以取得較好的效果。

用索式提取器提取脂肪：恒重濾紙（脫脂后的濾紙）筒，然后稱其質(zhì)量m1。恒重是指物品經(jīng)連續(xù)兩次加熱干燥，冷卻后稱得其質(zhì)量相差不超過規(guī)定量，一般規(guī)定為0.2～0.3mg。稱取青莢葉樣品，全部移至已恒重過的濾紙筒內(nèi)，稱得其總質(zhì)量m2。將濾紙筒放入脂肪提取器的抽提筒內(nèi)，連接已干燥的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入無水乙醚至容積的2/3處，于75℃水浴上加熱，使乙醚不斷回流提?。?2次/h），抽提5h。提取結(jié)束時(shí)檢查脂肪是否提取完全的方法為，用玻璃棒蘸取抽提管中的乙醚一滴滴在濾紙上，乙醚揮發(fā)后無油跡即可。冷卻至室溫后，自上而下拆除抽提器，把單口燒瓶和濾紙筒放實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干。稱取風(fēng)干后的濾紙筒與青莢葉樣品的總質(zhì)量m3。將風(fēng)干后的青莢葉樣品移入干凈的濾紙（脫脂后）中，放入干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。青莢葉的脂肪含量按以下公式計(jì)算：

青莢葉的脂肪含量見表1。

表1 青莢葉的脂肪含量

1.2 儀器及試劑

（1）儀器。萬能植物粉碎機(jī)，722型分光光度計(jì)，索式提取器，量筒（100ml），電子分析天平，圓底燒瓶，冷凝管，鐵架臺(tái)，電子恒溫水浴鍋，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵抽濾裝置，濾紙，RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海榮生），循環(huán)式多用真空泵，XK96-B快速混勻器，離心機(jī)，吸量管，分液漏斗，燒杯，吸管，玻璃棒，具塞比色管（25ml，50ml），微量取液器（100μl），吸耳球，漏斗，UV-1601型分光光度計(jì)，容量瓶，稱量瓶，烘箱，Zeeman偏振效應(yīng)背景校正器，Tech -315A型電熱板，錐形瓶，漏斗。

（2）試劑。濃硝酸，葡萄糖，苯酚，濃硫酸，無水乙醚，石油醚，氯仿，正丁醇，95%乙醇，無水乙醇，La2O3，鹽酸，以上均為分析純；高氯酸（G·R），去離子水，高純水；試驗(yàn)中所用玻璃器材均用HNO3（20%）浸泡24h以上，再用去離子水沖洗干凈，烘干后防塵儲(chǔ)藏備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 苯酚試液的配制

基于不確定測(cè)度的電力系統(tǒng)抗差狀態(tài)估計(jì):(二)模型方法//陳艷波,謝瀚陽,王鵬,王金麗,劉進(jìn),王若蘭//(2):26

用電子分析天平精確稱取苯酚10g于棕色瓶中，加150ml去離子水溶解，振蕩搖勻，貼上標(biāo)簽備用（臨用前配制）[3]。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的分析純葡萄糖100mg,置于100ml容量瓶中加去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為1×103mg/l的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液備用。精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1×103mg/l)0μl，100μl于25ml具塞比色管中，加蒸餾水至2.0ml，再分別加苯酚溶液1.0ml，搖勻，迅速加入濃H2SO4溶液5.0ml，搖勻后室溫放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫；在UV-1601型分光光度計(jì)上，以相應(yīng)的試劑為空白，于400～600nm處每隔5～10nm測(cè)定一次吸光度，得λmax=490nm。其測(cè)定結(jié)果見表2、圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液不同波長(zhǎng)下的吸收光譜曲線

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[4]

精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1×103mg/l)0μl，10μl，20μl，40μl，60μl，80μl，100μl于25m1具塞比色管中，加蒸餾水至2.0ml，再分別加苯酚溶液1.0ml，搖勻，迅速加入濃H2SO4溶液5.0ml，搖勻后室溫放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫；在UV-1601型分光光度計(jì)上，以相應(yīng)的試劑為空白，于490nm處測(cè)定吸光度。其測(cè)定結(jié)果見表3、圖2。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作回歸處理得回歸方程：A=0.050416C-0.00862，r=0.9997。

2.4 多糖的提取及精制

表3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液下不同容積的吸光度值

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

用電子分析天平精確稱取三份脫脂后的青莢葉分別為3.9750g、1.0004g、1.0004g，置于圓底燒瓶中，分別加入120ml去離子水，于90℃水浴中加熱（至水浴溫度升高開始計(jì)時(shí)）1h。把脫脂后的濾紙剪好置于抽濾瓶的漏斗中，將提取液趁熱進(jìn)行抽濾。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（50℃，90rpm）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將抽濾液中去離子水除去，使濾液減壓縮至6ml左右。將減壓濃縮后的溶液移入離心管中，加入20ml氯仿-正丁醇混合溶劑（4:1），用XK-96B快速混勻器劇烈振蕩20min，放入離心機(jī)中離心（3000r/min）10min，離心后于分液漏斗中萃取，棄去中間層的變性蛋白質(zhì)及下層的有機(jī)液，保留上清液于干凈的小燒杯中（連續(xù)離心萃取3次）[5]。用電子分析天平精確稱取1.0000g活性炭倒入燒杯中，用試管夾固定燒杯于沸水浴中加熱，并用玻璃棒不斷攪拌。然后過濾，將活性炭除去。連續(xù)脫色兩次，得青莢葉多糖。

精確稱取青莢葉多糖50mg，置于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻制得青莢葉多糖儲(chǔ)備液，吸取儲(chǔ)備液200μl，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法測(cè)定吸光度，在UV-1601型分光光度計(jì)上，以相應(yīng)的試劑為空白，于489.5nm處測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長(zhǎng)相近，推測(cè)為多糖。其測(cè)定結(jié)果見表4、圖3。

從吸收光譜標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出供試液中多糖的含量，按以下公式計(jì)算：

其中，m為多糖的質(zhì)量（mg），ρ為供試液中多糖的濃度（mg/l），v為供試液的體積（ml），d為多糖的稀釋因素[6]；吸光度為0.2292，相應(yīng)的葡萄糖濃度為4.72mg/l，換算因素F=10.59。

表4 樣品溶液不同波長(zhǎng)下的吸光度值

圖3 吸收光譜標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 樣品的測(cè)定

從燒杯中吸取50μl的樣品液，加去離子水定容于50ml具塞比色管中，用微量取液器吸取2ml稀釋液，加苯酚試液1.0ml，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0ml，搖勻后放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫，另以蒸餾水2.0ml，加苯酚和硫酸，與上述操作做空白對(duì)照。用UV-1601型分光光度計(jì)于489.5nm處測(cè)定吸光度[7]。其測(cè)定結(jié)果見表5。從圖2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品液中多糖的含量，按以下公式計(jì)算：

多糖含量=ρvdF/m

其中，ρ為樣品溶液中多糖的濃度（mg/l），v為樣品溶液的體積（ml），d為樣品的稀釋因素，F(xiàn)為換算因素，m為樣品的質(zhì)量（mg）。

2.7 精密度試驗(yàn)

（1）儀器的精密度試驗(yàn)。將提取的多糖樣品液重復(fù)測(cè)定5次，求其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，所測(cè)定RSD為0.0355%，說明此儀器的精密度較高。其試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 青莢葉多糖含量測(cè)定精密度試驗(yàn)結(jié)果(N=5)

（2）方法的精密度試驗(yàn)。將同一批樣品平行測(cè)定2次，求其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，所測(cè)定的RSD為0.693%，說明此方法的精密度高或重現(xiàn)性好。其試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 青莢葉多糖含量測(cè)定重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果(N=2)

2.8 回收率測(cè)定

采用標(biāo)樣加入法,用微量取液器吸取1.0ml稀釋液，向其中加入50μl葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測(cè)定吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品液加標(biāo)前和加標(biāo)后中多糖的含量,測(cè)定該方法的回收率。采用標(biāo)樣加入法測(cè)得平均回收率為100.7%。結(jié)果表明，此方法的準(zhǔn)確度高。

3 討 論

多糖的測(cè)定方法很多,如蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、水楊酸法、斐林法。由于苯酚-硫酸法操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，因而本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。實(shí)驗(yàn)中所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線好,通過回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)可知,本方法所測(cè)多糖含量準(zhǔn)確率較高，且方法簡(jiǎn)便、靈敏,在今后應(yīng)用苯酚-硫酸法測(cè)定青莢葉多糖含量時(shí)具有一定的參考價(jià)值。

在測(cè)定青莢葉多糖含量時(shí)，保持較高的硫酸濃度非常重要，因?yàn)樵擄@色反應(yīng)是以對(duì)多糖的水解和糠醛反應(yīng)為基礎(chǔ)的，硫酸濃度降低，會(huì)影響兩種反應(yīng)的進(jìn)行，由于樣品溶液及苯酚的加入量都會(huì)影響硫酸的濃度，因而必須控制一個(gè)合適的比例。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，測(cè)量結(jié)果可靠，測(cè)定了青莢葉多糖平均含量為274.3μg/g，多糖的含量較為豐富。由于多糖大多具促進(jìn)免疫、抗病毒、抗腫瘤等活性，青莢葉富含多糖，青莢葉具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

[1]婁方明，白志川，楊娟.長(zhǎng)葉胡頹子與中華青莢葉化學(xué)成分研究[D].重慶:西南大學(xué)，2006.

[2]王開發(fā)，支崇遠(yuǎn)，王隆華.我國(guó)花粉多糖測(cè)定及其意義[J].養(yǎng)蜂科技，2004(3):2-3.

[3]Gabriela Cuesta, Norma Suarez，Maria I Bessio，et al. Quantitative Determination of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Serotype 14 Using a Modification of Phenol-sulfuric acid Method[J]. Microbiological Methods，2003，52(1):69-73.

[4]魯建江，王莉，顧承志，等.商陸多糖的微波提取及含量測(cè)定[J].首都醫(yī)藥，2002(5):55-56.

[5]張雙鳳，林香娟，于村.苯酚-硫酸法測(cè)定胖大海涼茶中多糖的研究[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2000，11(3):144-145.

[6]吳擁軍，劉潔，吳予明，等.中藥巴戟天多糖的測(cè)定及其微量元素的分析[J].光譜學(xué)與光譜分析，2005，12(25):2077-2078.

[7]高麗君，王漢忠，崔建華，等.苯酚-硫酸法測(cè)定白首烏中多糖含量[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，35(2):295-297.

[責(zé)任編輯：李 潔]

Extraction and Determination of Helwingia Japonica Polysaccharides

LI Shuangmei
(Petrochemical Engineering and the Environment Engineering Environment, Puyang Vocational and Technical College, Puyang, 457001, China)

To develop Helwingia japonica resources, the phenol - sulfuric acid method is applied to determine the content of polysaccharide and the result is 274.3μg/g. This method is simple, rapid and accurate. Helwingia japonica contains a wealth of polysaccharide, and will have a prosperous future.

Polysaccharide; Phenol- sulfuric acid method; Helwingia japonica

R284.2

A

1671-4326(2010)02-0049-04

2009-12-26

國(guó)家自然科學(xué)基金（20675073）

李雙妹（1971—），女，河南濮陽人，濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院石油化工與環(huán)境工程系講師，碩士研究生.