YAP信號通路在姜黃素誘導HepG2肝癌細胞系凋亡中的作用

于洪丹，張舒文，谷學靜

(1.錦州醫(yī)科大學遼寧省糖尿病感知功能障礙重點實驗室;2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科;3.錦州醫(yī)科大學人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121000)

肝癌是導致全球癌癥患者死亡的第三大原發(fā)性惡性腫瘤，每年死亡人數(shù)超過60萬人。早期肝癌患者以手術為首要治療手段，但是對于中晚期肝癌或者術后化療患者仍以藥物治療為主[1-3]。植物源性中藥以其毒性低，副作用小而成為近年來關注的熱點。姜黃素是從姜科、天南星科植物的根莖中提取的重要活性成分之一，在骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多種類型腫瘤中表現(xiàn)出抗腫瘤活性[4-5]，但姜黃素在肝癌中的作用及確切機制尚需進一步研究[6]。本研究擬觀察姜黃素對HepG2肝癌細胞系增殖、凋亡的影響及機制，期望為肝癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療參考。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人HepG2肝癌細胞系(北納生物)，姜黃素(純度≥99%，沈陽藥科大學藥劑學教研室贈送)，RPMI-1640 (BIOIND)，增強型CCK-8試劑盒(尚寶生物)，ROS檢測試劑盒(碧云天)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(索來寶)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒(索來寶)，單克隆抗體GAPDH(華美生物)，Cleaved caspase-3、細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、Yes相關蛋白(yes-associated protein，YAP)、HRP標記二抗(proteintech)。

1.2 細胞培養(yǎng)與實驗分組

HepG2肝癌細胞復蘇后置于含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，0.25%胰酶消化、傳代，取對數(shù)生長期細胞進行相關實驗。稱取10 mg姜黃素，溶于0.5 mL DMSO，再利用培養(yǎng)基稀釋終濃度為5、10、20 μg/mL姜黃素溶液，DMSO 終濃度最高為1‰。對照組為正常培養(yǎng)基，DMSO組為含1‰的DMSO培養(yǎng)基。

1.3 細胞形態(tài)學觀察及細胞增殖檢測

取對數(shù)生長期的HepG2肝癌細胞接種于96孔板內(nèi)，控制細胞數(shù)量為2×103個/孔，貼壁后更換含有姜黃素的培養(yǎng)基100 μL，每個濃度5個復孔。24、48 h后倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，觀察拍照，再分別加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù) 培養(yǎng)1 h，于490 nm測定吸光度(A)。計算細胞活力(cell viability)=(A實驗組-A空白)/(A對照組-A空白)×100%。

根據(jù)細胞形態(tài)觀察和細胞增殖檢測結果，取10 μg/mL的姜黃素培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h檢測以下各項指標。

1.4 流式細胞法檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的HepG2肝癌細胞接種于6孔板內(nèi)，控制細胞數(shù)量為1×106個/孔，貼壁后分組培養(yǎng)48 h，再胰酶消化收集細胞(1×106/mL)，預冷的PBS清洗兩遍，300 g離心10 min，1 mL Bingding Buffer懸浮后棄上清，0.5 mL Binding Buffer重懸細胞，取100 μL細胞于流式管中(2×105個)，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后室溫避光孵育10 min，再加入5 μL PI室溫避光孵育5 min，加入PBS至500 μL。分別對Annexin V-FITC和PI染料作單陽對照，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.5 DCFH-DA熒光染色檢測細胞ROS水平

取對數(shù)生長期的HepG2肝癌細胞接種于6孔板內(nèi)，控制細胞數(shù)量為2×105個/孔，貼壁后分組培養(yǎng)48 h后更換10 μM 的DCFH-DA培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，PBS清洗去掉未裝載的探針，激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長525 nm，細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)檢測細胞ROS水平。

1.6 免疫印跡法(Western blot)檢測蛋白表達

取對數(shù)生長期的HepG2肝癌細胞接種于6孔板內(nèi)，控制細胞數(shù)量為1×106個/孔，貼壁后分組培養(yǎng)48 h，用RIPA細胞裂解液提取全蛋白，BCA法測定蛋白濃度，與上樣緩沖液混合后100 ℃煮沸5 min，配制10%～12%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠進行分離，濕轉法轉移到PVDF膜上，5% BSA進行封閉，4 ℃孵育一抗Cleaved caspase-3、Cyt C、YAP過夜，TBST清洗3次后室溫孵育二抗2 h，增強化學發(fā)光法檢測，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多組樣本之間的比較采用單因素方差分析及兩兩比較的SNK檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 姜黃素影響HepG2肝癌細胞系的形態(tài)學

顯微鏡觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，姜黃素對HepG2肝癌細胞系的形態(tài)學影響表現(xiàn)出明顯的時間依賴性和劑量依賴性。10 μg/mL姜黃素作用48 h后，貼壁細胞數(shù)量明顯減少，大量細胞失去原有形態(tài)，外形變圓，邊緣變亮，與20 μg/mL姜黃素作用24 h或48 h后細胞形態(tài)變化類似，見圖1。

圖1 姜黃素對HepG2肝癌細胞形態(tài)的影響

2.2 姜黃素抑制HepG2肝癌細胞系的增殖

CCK-8試劑盒檢測結果顯示，姜黃素對HepG2肝癌細胞系的增殖有明顯的抑制作用。與對照組相比，5 μg/mL姜黃素作用24 h和48 h后細胞抑制作用不明顯(P>0.05)，10 μg/mL和20 μg/mL姜黃素作用24 h和48 h均表現(xiàn)出明顯抑制效應(P<0.05)。10 μg/mL和20 μg/mL姜黃素組與5 μg/mL姜黃素組相比，同樣具有統(tǒng)計學意義(#P<0.05)。本研究選取10 μg/mL姜黃素處理細胞48 h開展后續(xù)實驗，見圖2。

圖2 姜黃素對HepG2肝癌細胞增殖抑制率的影響

2.3 姜黃素誘導HepG2肝癌細胞系的凋亡

流式細胞儀檢測結果顯示，對照組細胞凋亡比例為10.24%，DMSO組細胞凋亡比例為14.50%，兩組相比未見顯著變化(P>0.05)，而姜黃素組細胞凋亡比例達到26.74 %，明顯高于對照組(P<0.05)。結果表明姜黃素能誘導HepG2肝癌細胞系的凋亡，見圖3。

其中右上象限代表晚期凋亡，右下象限代表早期凋亡

2.4 姜黃素促進HepG2肝癌細胞系ROS的產(chǎn)生

與對照組相比，姜黃素組細胞綠色熒光明顯，DMSO組無明顯變化。結果表明姜黃素組細胞ROS水平明顯升高，姜黃素能促進肝癌HepG2細胞發(fā)生氧化應激，見圖4。

圖4 姜黃素對HepG2肝癌細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的影響

2.5 姜黃素對YAP信號通路蛋白表達的影響

與對照組相比，凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3、Cyt C表達明顯升高，YAP的蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)，DMSO組無顯著變化(P>0.05)，見圖5。

圖5 姜黃素對HepG2肝癌細胞相關蛋白表達水平的影響

3 討 論

姜黃素是姜科植物姜黃根莖中存在的一種亮黃色疏水多酚類化合物，對多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多種類型腫瘤均表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性[5，7]1-13。姜黃素可通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用，如調(diào)節(jié)MAPK信號通路、Notch-1信號通路以及調(diào)節(jié)NF-κB、COX-2、ROS含量等[8-10]。姜黃素雙向調(diào)節(jié)氧化應激反應，在慢性腎病、痛風性關節(jié)炎等疾病中，具有降低線粒體中活性氧類物質、清除自由基的功能[11]；而在腫瘤細胞中，姜黃素及其類似物具有促進氧化應激，誘導腫瘤細胞凋亡的功能[12]。本研究中也發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著增加HepG2肝癌細胞系中ROS水平，促進氧化應激的發(fā)生。

YAP是一種重要轉錄調(diào)節(jié)因子，對腫瘤細胞的增殖和凋亡起到重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制胰腺癌細胞中YAP-Notch信號通路進而抑制癌細胞的增殖[13]，同樣在膀胱癌和結腸癌中也發(fā)現(xiàn)姜黃素可降低YAP信號通路起到抗腫瘤的作用[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素能明顯下調(diào)HepG2肝癌細胞系中YAP蛋白的表達。YAP可調(diào)控的蛋白包括細胞周期相關蛋白、p53凋亡信號相關蛋白、Wnt/β-catenin信號相關蛋白等[15-16]。此外，YAP還可以調(diào)控ROS的含量，如YAP能正調(diào)控抗氧化基因過氧化氫酶的轉錄，進而下調(diào)ROS水平[17]。與之類似，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制HepG2肝癌細胞YAP蛋白的表達，導致ROS在細胞內(nèi)堆積，發(fā)生了明顯的氧化應激。

適量的ROS能促進腫瘤細胞增殖，但大量的ROS產(chǎn)生會誘導腫瘤細胞凋亡[18]。高水平的ROS能促進細胞發(fā)生氧化應激反應、導致DNA氧化性損傷，激活p53依賴性凋亡信號通路[19]。細胞內(nèi)ROS的累積還會導致線粒體氧化性損傷，線粒體膜通透性發(fā)生改變，引起bcl-2家族促凋亡蛋白Bax上調(diào)，抑凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)，促使線粒體釋放細胞色素C (cytochrome C，Cyt C)到胞質中，導致caspase家族的凋亡執(zhí)行蛋白Caspase 3激活，最終引發(fā)細胞的凋亡過程[20]。本研究中，伴隨著ROS的堆積，HepG2肝癌細胞系發(fā)生了明顯的凋亡。因此，姜黃素可能通過誘發(fā)氧化應激的機制誘導了HepG2肝癌細胞系凋亡。

綜上所述，本研究中姜黃素在HepG2肝癌細胞系中表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，可抑制HepG2細胞增殖，促進細胞凋亡。其機制可能與姜黃素抑制YAP表達，促進ROS在細胞內(nèi)堆積，誘發(fā)氧化應激反應，進而引發(fā)凋亡反應相關。