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    金絲桃苷對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的影響及機(jī)制

    2020-08-08 07:27:48付強(qiáng)金向楠郜玉忠王健閆鵬
    關(guān)鍵詞:阻斷劑滑膜誘導(dǎo)

    付強(qiáng),金向楠,郜玉忠,王健,閆鵬

    (1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)運(yùn)動科;2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,遼寧 錦州 121000)

    類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以慢性炎癥為特征的一種自身免疫性關(guān)節(jié)疾病,炎性免疫細(xì)胞侵潤到滑膜液并造成軟骨破壞[1]。異常過度增殖的成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,F(xiàn)LS)在這種炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞機(jī)制中起關(guān)鍵作用,它通過產(chǎn)生炎性介質(zhì),如腫瘤壞死因子(TNF-α),前列腺素E2(PGE2),一氧化氮(NO),白細(xì)胞介素(IL)-6等發(fā)揮作用,其中IL-1β也是較為重要的一種,高水平的IL-1β持續(xù)刺激滑膜細(xì)胞可以引起細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的持續(xù)激活和信號通路的過度傳導(dǎo),從而使一氧化氮合酶(iNOS),環(huán)氧化酶(COX),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)水平上調(diào)[2]。這些蛋白酶表達(dá)量的多少決定著關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度,隨著時(shí)間的延長產(chǎn)生進(jìn)行性的關(guān)節(jié)破壞,甚至最終導(dǎo)致畸形和殘疾。

    絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,MAPKs通路調(diào)控從胚胎生發(fā),細(xì)胞分化到細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活/凋亡的所有細(xì)胞功能。MAPKs可分類成三種類型:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2),p38蛋白,和c-Jun N-末端激酶(JNK)[1]233-255。細(xì)胞因子IL-1β被證實(shí)能夠誘導(dǎo)人的FLS通過p38途徑使得NO和PEG2的產(chǎn)生增多[3]。

    金絲桃苷(hyperin,Hyp)又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷,屬黃酮醇苷類化合物,廣泛存在于各種植物體內(nèi),如金絲桃科、薔薇科、桔??啤⒖?、藤黃科、豆科等的果實(shí)與全草中,藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化,改善心血管循環(huán)功能等藥物作用[4]。目前,一些研究證明Hyp通過抑制TNF-α,IL-6和NO等炎癥因子的產(chǎn)生,有顯著的抗炎作用,還有一些研究發(fā)現(xiàn)Hyp在體外可以顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[5]。然而,對于Hyp是否能夠抑制RA-FLS類腫瘤樣的侵蝕特性,目前尚無研究報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)就針對Hyp是否會對RA有抗炎和抑制軟骨受侵蝕作用進(jìn)行研究。

    1 材 料

    1.1 滑膜組織的來源

    RA滑膜組織取自錦州附屬大學(xué)第一醫(yī)院2018年9月至12月行關(guān)節(jié)鏡術(shù)的3例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者,RA患者均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會制定的RA分類標(biāo)準(zhǔn),所有患者均已簽署知情同意書,符合倫理學(xué)要求并經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.2 主要藥品與試劑

    Ⅱ型膠原酶和胎牛血清購于GIbco公司;DMEM/F12培養(yǎng)基購于Hyclone公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)和胰蛋白酶購于碧云天生物技術(shù)研究所;金絲桃苷(Hyperin),黃色粉末,純度>98%,購于南京春秋生物工程有限公司;白細(xì)胞介素(IL)1-β購于Sigma公司;SB203580阻斷劑購于Abcam公司 ;iNOS 抗體、MMP3抗體、p38抗體、山羊抗兔二抗、 山羊抗鼠二抗、β-actin、BrdU Cell Proliferation Assay Kit均購于Cell Signaling公司;Transwell購于Corning公司。

    2 方 法

    2.1 滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)

    在無菌條件下,將手術(shù)中獲取的滑膜組織,用眼科剪刀剪碎,移入含有終濃度為0.5 mg/mL的Ⅱ型膠原酶的培養(yǎng)基中,于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中消化2 h,取出后用吸管反復(fù)吹打,并經(jīng)70 μm孔徑的紗網(wǎng)過濾后離心,沉淀重懸,移入培養(yǎng)瓶放置于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中,每2~3 d換液1次,待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),本實(shí)驗(yàn)使用FLS,純度達(dá)到95%以上的3~7代細(xì)胞。

    2.2 分組處理方法

    本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為4種處理方法,正常對照組:細(xì)胞無需特殊處理,加入等量的培養(yǎng)基,誘導(dǎo)組:加入終濃度為10 ng/mL的IL-1β,誘導(dǎo)用藥組:分別加入終濃度為10、50、100 μm/mL的Hyp+ IL-1β(10 ng/mL),誘導(dǎo)阻斷劑組:加入終濃度為20 μm/mL 的SB203580+IL-1β(10 ng/mL),單獨(dú)用藥組:分別加入Hyp(10、50、100 μm/mL)。

    2.3 Brdu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

    取對數(shù)生長期的FLS細(xì)胞,消化后以1×104/孔的密度均勻接種于96孔板中,隔天加藥前給予饑餓處理,然后分別加入Hyp和SB203580(20 μm/mL),作用48 h,在藥物和阻斷劑作用24 h后誘導(dǎo)組給予加入IL-1β(10 ng/mL),對照組加入等量培養(yǎng)基。將Brdu原液1:500稀釋在藥物作用結(jié)束前8 h每孔加入20 μL,然后按照Brdu細(xì)胞增殖試劑盒說明書所示方法操作,用酶標(biāo)儀在450 nm波長條件下測定各孔OD值。

    2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

    取對數(shù)生長期的FLS細(xì)胞,消化后用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基制成密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液,于每個(gè)transwell小室上室中加入100 μL細(xì)胞懸液,培養(yǎng)24 h。24 h后依照分組在上室中加入Hyp和SB203580,對照組加入等量培養(yǎng)基,下室中均加入含IL-1β的10%胎牛血清培養(yǎng)基600 μL,上室藥物作用24 h。取出后用結(jié)晶紫染色放置于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

    2.5 Western Blot檢測細(xì)胞蛋白水平

    將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng),每組3復(fù)孔,待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上,給予加藥處理,分別加入Hyp(50、100 μm/mL)和SB203580(20 μm/mL)作用4 h,在藥物和阻斷劑作用結(jié)束前2 h誘導(dǎo)組給予加入IL-1β(10 ng/mL),對照組加入等量培養(yǎng)基,制樣。用10% 聚丙烯酰胺凝膠 ( SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì),電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉 60 min,加入相應(yīng)一抗,4 ℃過夜,洗去一抗后,加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗,最后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色,結(jié)果用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析,以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量[6]。

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次,結(jié)果采用SPSS 17.0軟件處理分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較應(yīng)用單因素方差(One-Way ANOVA)分析,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié) 果

    3.1 Hyp對IL-1β誘導(dǎo)的人RA-FLS增殖能力的影響

    分析酶標(biāo)儀測得數(shù)據(jù)顯示:IL-1β明顯的誘導(dǎo)了RA-FLS的增殖,與正常對照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。誘導(dǎo)用藥組與誘導(dǎo)組相比呈劑量依賴性的抑制了FLS的增殖,終濃度為50,100 μm/mL的Hyp誘導(dǎo)用藥組與誘導(dǎo)組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001),誘導(dǎo)阻斷劑組與誘導(dǎo)組相比也有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001),說明p38的阻斷劑SB203580也明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的RA-FLS增殖能力,見圖1。

    與正常對照組比***P<0.001,與IL-1β誘導(dǎo)組比###P<0.001

    3.2 Hyp對IL-1β誘導(dǎo)的人RA-FLS遷移能力的影響

    在倒置顯微鏡(×100)下將每個(gè)小室分為9個(gè)面積相等的視野,分別計(jì)數(shù)穿過的細(xì)胞數(shù)量,算出平均值統(tǒng)計(jì)分析。如圖所示(見圖2A),我們觀察到50、100 μm/mL的Hyp成劑量依賴性的抑制了IL-1β誘導(dǎo)的FLS縱向的遷移能力,SB203580阻斷劑組也同樣有抑制遷移作用。分析結(jié)果顯示,用藥組和阻斷劑組與正常對照組相比均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001),見圖2B。

    A:a.正常對照組;b.金絲桃苷(50 μm/mL)-用藥組;c.金絲桃苷(100 μm/mL)-用藥組;d.SB203580(20 μm/mL)-阻斷劑組

    3.3 Western Blot測定Hyp對蛋白表達(dá)水平的影響

    3.3.1 Hyp對iNOS蛋白表達(dá)水平的影響

    Western Blot結(jié)果顯示,IL-1β刺激RA-FLS使iNOS的蛋白表達(dá)量明顯增加,與正常對照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。而應(yīng)用p38阻斷劑SB203580組iNOS的蛋白表達(dá)量相應(yīng)的有所降低,用藥組劑量為50、100 μm/mL的Hyp使得iNOS的蛋白表達(dá)量成劑量依賴性降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù):誘導(dǎo)用藥組和誘導(dǎo)阻斷劑組與誘導(dǎo)組相比均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001),見圖3。

    與正常對照組比***P<0.001,與IL-1β誘導(dǎo)組比###P<0.001

    3.3.2 Hyp對MMP3蛋白表達(dá)水平的影響

    Western Blot結(jié)果顯示,IL-1β刺激RA-FLS使MMP3的蛋白表達(dá)量明顯增加,與正常對照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。而應(yīng)用p38阻斷劑SB203580組MMP3的蛋白表達(dá)量相應(yīng)的有所降低,用藥組劑量為50、100 μm/mL的Hyp使得MMP3的蛋白表達(dá)量成劑量依賴性降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù):誘導(dǎo)用藥組和誘導(dǎo)阻斷劑組與誘導(dǎo)組相比均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001),見圖4。

    與正常對照組比***P<0.001,與IL-1β誘導(dǎo)組比###P<0.001

    3.3.3 Hyp對p38蛋白表達(dá)水平的影響

    Western Blot結(jié)果顯示,IL-1β刺激RA-FLS使p38的蛋白表達(dá)量明顯增加,與正常對照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。誘導(dǎo)用藥組與誘導(dǎo)組相比呈劑量依賴性的抑制了p38蛋白的表達(dá)水平,終濃度為50、100 μm/mL的Hyp誘導(dǎo)用藥組與誘導(dǎo)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001),見圖5。

    與正常對照組比***P<0.001,與IL-1β誘導(dǎo)組比###P<0.001

    4 討 論

    在RA中,最顯著的特點(diǎn)之一是FLS的過度增殖,這種滑膜細(xì)胞參與著炎癥和關(guān)節(jié)破壞,類腫瘤樣生長使它具有不同尋常的增殖性及侵襲性,這種增殖性及侵襲性是多種因素決定的[7-8]。我們注意到RA滑膜中存在過量的細(xì)胞因子、受體及與其有相似性的癌基因產(chǎn)物,他們可以作用在滑膜細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑中的不同位置,導(dǎo)致持續(xù)的信號傳導(dǎo),從而引起RA滑膜細(xì)胞的異常增生。目前各種治療RA方法發(fā)展迅速,以FLS侵襲為靶點(diǎn)的藥物研究已成為近年來抗RA藥物研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn),新藥和新療法層出不窮,極大地改善了病人的預(yù)后,但由于調(diào)控RA-FLS侵襲的復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)使靶向單一治療束手無策,多種改善病情抗風(fēng)濕藥聯(lián)合治療給患者帶來的藥物副作用越來越多,臨床上仍缺乏安全有效的治療方法。金絲桃苷分子式為C21H20O12,相對分子量為464.3763,毒性極低,且已有研究表明它對心肌缺血、腦缺血、肝及胃粘膜有保護(hù)作用,還具有降血脂、解痙陣痛作用,為了探討Hyp是否可以作為一種副作用小的中藥同樣應(yīng)用于RA,我們研究了Hyp對IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS增殖與遷移能力的影響。

    因脫離機(jī)體環(huán)境而體外培養(yǎng)的RA-FLS經(jīng)幾次傳代后,其炎癥因子的產(chǎn)生及遷移能力均會減弱,所以我們要對其進(jìn)一步的誘導(dǎo),IL-1β是多種RA誘導(dǎo)因子之一,有證據(jù)指出,IL-1β通過誘發(fā)FLS的增殖和炎性反應(yīng)在RA滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。Fonsa 等報(bào)道滑膜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射IL-1β可以刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生包括MMP在內(nèi)的炎性介質(zhì),從而引發(fā)蛋白多糖、膠原的降解和軟骨細(xì)胞的破壞。此外,IL-1β還能刺激中性蛋白酶和前列腺素E2的產(chǎn)生,增強(qiáng)關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng),促進(jìn)滑膜巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分化為破骨細(xì)胞,導(dǎo)致邊緣骨質(zhì)的破壞。我們通過Brdu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察到IL-1β(10 ng/mL)明顯誘導(dǎo)了RA-FLS的增殖及遷移,發(fā)現(xiàn)100 μm/mL的Hyp可以顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞增殖和遷移,意味著Hyp用于治療RA是有效果的[9]。

    在檢測Hyp抑制FLS增殖和遷移能力的同時(shí),本研究還在蛋白表達(dá)水平分別檢測了藥物對FLS產(chǎn)生iNOS及MMP3的影響。NO是IL-1β下游的重要炎性介質(zhì)之一,通過調(diào)節(jié)軟骨的合成和分解代謝維持軟骨穩(wěn)態(tài)的平衡,是導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)破壞的重要因素[2]437-445。iNOS是NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶,在正?;ぜ?xì)胞中沒有表達(dá),但由IL-1β等細(xì)胞因子誘導(dǎo)的FLS可以使iNOS過度表達(dá),炎性環(huán)境下iNOS的表達(dá)活性一旦被激活,便可持續(xù)性表達(dá),從而產(chǎn)生大量的NO,高水平的NO介導(dǎo)廣泛的毒性作用,一方面進(jìn)一步促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放,誘導(dǎo)iNOS的產(chǎn)生,形成一種惡性循環(huán),導(dǎo)致RA的關(guān)節(jié)軟骨處于一種持續(xù)性侵蝕狀態(tài),另一方面可以使MMPs高表達(dá)而導(dǎo)致FLS的遷移和侵襲性增加[10]。

    MMPs是導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙的重要效應(yīng)分子之一,幾乎能夠降解除了多糖以外全部的膠原、蛋白多糖等主要基質(zhì)成分,通過直接遷移到細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨和軟骨的破壞[11]。MMPs的活性調(diào)控包括多個(gè)方面,蛋白表達(dá)量的多少,酶原的活化以及與金屬蛋白酶組織特異性抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)比例的不平衡。在眾多的MMPs中,可以檢測到RA患者的滑液中MMP1、2、3、8、9均是高水平表達(dá)的,并有研究發(fā)現(xiàn)RA-FLS中表達(dá)MMP1和MMP3遷移和侵襲能力更強(qiáng)[12-13]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此是相符的IL-1β誘導(dǎo)了FLS產(chǎn)生大量的iNOS和MMP3,其表達(dá)較正常對照組顯著增高,而Hyp組使得iNOS和MMP3的蛋白表達(dá)量成劑量依賴性降低。

    MAPKs是參與細(xì)胞功能的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在RA中,MAPK途徑廣泛的介導(dǎo)了滑膜細(xì)胞的增殖和炎性反應(yīng),他們或是可以激活其他的蛋白激酶,或是可以磷酸化細(xì)胞骨架,或是直接轉(zhuǎn)位入核,磷酸化轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)控下游基因的表達(dá),如一方面,通過炎癥因子激活的MAPK可以活化下游轉(zhuǎn)錄因子(如ATF-2、AP-1等),進(jìn)一步上調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等的表達(dá),形成正反饋,它是RA患者局部和全身炎癥持續(xù)存在的重要機(jī)制,另一方面,MAPK途徑的下游的一些基因參與了RA的組織破壞,如JNL、p38是MMP表達(dá)的必須調(diào)節(jié),特別是p38通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)對骨侵蝕有極大的影響[14]。在IL-1β的刺激下FLS表達(dá)p38的水平明顯增高,p38的激活在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控下游因子的表達(dá),最終進(jìn)一步上調(diào)了TNF、IL、iNOS、MMPs、COX2、PGE2等的表達(dá)水平,并形成一種正反饋,是RA為慢性持續(xù)性炎癥疾病的重要機(jī)制[14-15]563-571。研究發(fā)現(xiàn)通過抑制p38激酶,可以打破這回惡性循環(huán),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn),并通過研究藥物對其及其下游因子表達(dá)的影響,為Hyp對p38激酶途徑的抑制作用提供進(jìn)一步的證明。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Hyp顯著抑制了IL-1β誘導(dǎo)的FLS增殖及遷移能力,此外,在轉(zhuǎn)錄水平上還抑制了iNOS、MMP3和p38蛋白表達(dá)量,表明Hyp具有抑制增殖和控制關(guān)節(jié)和軟骨受侵蝕的效果,可以作為RA治療的一個(gè)理想的新藥進(jìn)行更多的研究。我們證明了Hyp能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的FLS對 MMP3和iNOS的過度表達(dá),還表明藥物是通過阻斷IL-1β激活的p38通路而發(fā)揮作用的,但這是否是Hyp作用于RA的主要機(jī)制,還需要更深一步的研究。

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