苓桂術(shù)甘湯對慢性心力衰竭大鼠AngⅡ、ET-1、BNP的影響

李雪萍，張寶成，黃 聰，魏蜀君，姚 歡，高永翔

慢性心力衰竭 (chronic heart failure，CHF)是指心臟泵血功能降低，心臟血液輸出量減少，不能滿足全身組織代謝需要的一種病理生理狀態(tài)及臨床綜合征，目前全球心力衰竭病人的數(shù)量已高達2 250萬人，并且仍以每年200萬人的速度遞增，且5年存活率與惡性腫瘤相仿[1]。目前研究表明，心室重構(gòu)是CHF發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機制[2]。心室重構(gòu)是指為了適應(yīng)心臟血流動力學(xué)而改變心臟結(jié)構(gòu)和功能，以維持正常的心排血量，最終導(dǎo)致失代償性心力衰竭。心室重構(gòu)開始時會引起神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)大量細胞因子的異常分泌，經(jīng)過一定的代償作用后，會使心肌損傷加重，從而導(dǎo)致心功能惡化[3]。 2014年中國心力衰竭指南指出應(yīng)重視和加強深入探索采用中醫(yī)藥防治心力衰竭，正是當前國內(nèi)外研究熱點之一[4]。中醫(yī)藥治療CHF積累了豐富的經(jīng)驗，其中以脾胃論治療效突出，芩桂術(shù)甘湯是健脾利水、溫陽益飲的經(jīng)方，張仲景《金匱要略》曰：“心下有痰飲，胸脅支滿，目眩，苓桂術(shù)甘湯主之”。本課題旨在通過動物實驗研究探討苓桂術(shù)甘湯治療CHF的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠40只， 體質(zhì)量(220±20)g，批號51203500001623，由四川達碩科技有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2015-030。實驗環(huán)境：清潔級動物房，室內(nèi)溫度維持在20～25 ℃，室內(nèi)濕度維持在40%～70%，大鼠分籠，并予以普通級飼料及純凈水飼養(yǎng)，每日定時更換飲用水，普通飼料由成都達碩生物科技有限公司提供。

1.1.2 實驗藥物 苓桂術(shù)甘湯臨床常用劑量：茯苓20 g，桂枝15 g，白術(shù)15 g，炙甘草15 g。購于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，為新綠色藥業(yè)中藥配方顆粒，性狀：浸膏顆粒。阿霉素每瓶10 mg，山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：02160901。地高辛片每盒0.25 mg，30片，上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，批號：02160607。

1.1.3 儀器與試劑 低溫離心機(德國HERASE)；酶標儀(Varioskan Flash美國熱電公司)；Vivid E9彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)；SD大鼠血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ) ELISA試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供，生產(chǎn)批號：Lot#R20170824；SD大鼠內(nèi)皮素-1(ET-1)ELISA試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供，生產(chǎn)批號：Lot#R20170824；SD大鼠腦鈉肽(BNP)ELISA試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供，生產(chǎn)批號：Lot#R20170824。

1.2 心力衰竭模型建立及分組方法 選用清潔級雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，再運用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0進行隨機數(shù)字分組，使用3%苦味酸溶液編號。隨機分為空白組(7只)與造模組(33只)。其中造模組在造模成功后再隨機分為模型組、地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組，每組11只。

造模方法：大鼠心力衰竭模型的建立，采用阿霉素誘導(dǎo)法[4]。首先用5 mL滅菌注射用水充分溶解阿霉素，混合均勻，再用生理鹽水進行稀釋，配制成濃度為0.8 mg/mL的試驗液，采用1.5 mg/kg劑量對大鼠進行腹腔注射，注射頻率為每周2次，連續(xù)注射周期為4周；空白組則注射同等劑量的生理鹽水，每周2次，共4周。從SD大鼠阿霉素腹腔注射日起開始定期觀察SD大鼠的行動活潑度、刺激反應(yīng)度、體毛顏色、食欲、水腫以及尿量等一般生理情況，并以此為依據(jù)初步判斷CHF造模是否成功。造模結(jié)束后2周內(nèi)，于各組隨機取2只大鼠，行心臟超聲心動圖檢查及病理學(xué)切片檢查，進一步明確SD大鼠的CHF造模是否成功。

給藥劑量：根據(jù)人與大鼠體表面積換算公式，苓桂術(shù)甘湯組灌胃劑量為6.83 g/(kg·d)，地高辛組灌胃劑量為0.027 mg/(kg·d)，空白組和模型組大鼠灌服同等體積的普通飲用水，按1 mL/100 g 劑量進行灌胃，灌胃持續(xù)周期為4周。每4 d稱取體重1次，并根據(jù)體重變化對用藥劑量進行相應(yīng)調(diào)整。為排除晝夜節(jié)律的影響，每天灌胃給藥時間固定。藥物劑量換算參考徐叔云《藥理實驗方法學(xué)》[5]，采用體表面積換算法。

1.3 觀察及檢測指標

1.3.1 一般情況觀察 定期觀察和記錄整個實驗過程，關(guān)注各組大鼠飲食和體重變化、行為活動靈敏性和精神狀態(tài)、身體有無水腫發(fā)生、全身皮膚及毛發(fā)的變化情況、二便等一般狀況。

1.3.2 心臟彩超檢測 腹腔注射10%水合氯醛，麻醉大鼠；將大鼠仰臥位固定于操作臺上，備皮，充分暴露胸部；檢測心力衰竭相關(guān)指標，包括左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室收縮末期容積(ESV)、左室舒張末期容積(EDV)，所有數(shù)據(jù)均測量3次并記錄。

1.3.3 血清AngⅡ、ET-1、BNP的測定 大鼠連續(xù)灌胃4周后，禁食、不禁水12 h，10 %水合氯醛以0.3 mL/100 g劑量對實驗大鼠進行腹腔注射。徹底麻醉后開胸暴露心臟，使用一次性真空采血針經(jīng)心尖部采集血液；收集的血液先于37 ℃恒溫鍋中靜置30 min，再用高速離心機(2 000 r/min)4 ℃離心15 min，將管內(nèi)上清液吸出，重新分裝編號，于-80 ℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清AngⅡ、ET-1、BNP水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。

1.3.4 心臟組織病理學(xué)檢測 右心室采血結(jié)束后，迅速取出大鼠心臟，用生理鹽水灌洗，存放于4%多聚甲醛24 h，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋制作成蠟塊，連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察大鼠心肌細胞的形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察結(jié)果 實驗過程中，空白組大鼠精神狀態(tài)良好、活躍，反應(yīng)較為敏捷，食量、飲水量正常，無脫毛，二便量、色質(zhì)均無明顯異常。 模型組大鼠出現(xiàn)精神不振，活動量相對減少，飲食量下降，全身毛發(fā)脫落且泛黃，無光澤，部分出現(xiàn)腹部隆起，大便稀軟。苓桂術(shù)甘湯組及地高辛組給藥10 d左右后精神狀態(tài)、活動度、飲食狀況改善，15 d后腹部膨隆現(xiàn)象減輕，大便正常。給藥結(jié)束后，苓桂術(shù)甘湯組存活8只，地高辛組存活7只，模型組及空白組各存活5只。

2.2 心臟組織病理形態(tài)學(xué)改變 正常組心肌細胞排列整齊，細胞核呈卵圓形，著色較淺無深染，未見心肌細胞肥大，間質(zhì)無炎癥細胞浸潤；模型組細胞排列疏松，橫紋不清楚，心肌纖維及間質(zhì)發(fā)生壞死，細胞水腫，胞質(zhì)著色變淺，細胞核出現(xiàn)深染改變，有炎癥細胞浸潤；苓桂術(shù)甘湯組和地高辛組心肌細胞肥大、炎癥細胞浸潤、心肌纖維走形等均得到不同程度的改善。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織HE染色(×100)

2.3 大鼠心臟超聲結(jié)果 模型組大鼠LVESD值高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而模型組大鼠LVEF和LVEDD值低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，苓桂術(shù)甘湯組和地高辛組LVESD均有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示兩個藥物組大鼠的左室收縮期心室內(nèi)徑下降，左室收縮功能有所改善；苓桂術(shù)甘湯組和地高辛組LVEF和LVEDD均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示藥物組左室舒張期心室內(nèi)徑升高，心排血量增加，心功能改善。與空白組相比，苓桂術(shù)甘湯組和地高辛組LVEDD、LVEF明顯降低，LVESD明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示藥物能夠改善受損的心功能，但相比正常心臟功能仍有差距。苓桂術(shù)甘湯組與地高辛組相比，LVEF差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；苓桂術(shù)甘湯組LVEDD、LVESD較地高辛組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示苓桂術(shù)甘湯對心功能改善的作用效果不及地高辛。模型組心功能明顯下降，心室收縮、舒張功能均受損；苓桂術(shù)甘湯組和地高辛組均可改善心功能。

模型組大鼠EDV、FS值低于空白組，而ESV高于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示模型組大鼠的心功能相對下降，左心室收縮末期容量增加。苓桂術(shù)甘湯組和地高辛組EDV和FS高于模型組，而ESV低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示苓桂術(shù)甘湯、地高辛組心功能改善，左心室收縮末期容量相對降低。苓桂術(shù)甘湯組ESV、EDV、FS與地高辛組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組左室心室腔減小，心功能下降；苓桂術(shù)甘湯組和地高辛組心室腔容量增大，心室重構(gòu)延緩，改善心功能。詳見圖2、表1。

圖2 各組心臟超聲結(jié)果

表1 各組大鼠給藥后心功能指標比較(±s)

2.4 各組大鼠BNP、AngⅡ、ET-1水平比較 模型組與空白組比較，BNP、AngⅡ、ET-1水平明顯升高(P<0.01)，提示模型組大鼠心臟功能受損，心力衰竭模型造模成功。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯組、地高辛組BNP、AngⅡ、ET-1水平均降低(P<0.05或P<0.01)，提示苓桂術(shù)甘湯與地高辛在一定程度上能夠改善心力衰竭大鼠的心功能。苓桂術(shù)甘湯組與地高辛組相比，BNP、AngⅡ、ET-1水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠BNP、AngⅡ、ET-1比較(±s) 單位:ng/L

3 討 論

導(dǎo)致CHF發(fā)生發(fā)展的基本機制是心室重構(gòu)， 它是決定充血性心力衰竭發(fā)病率、 病程進展和死亡率的主要因素[6]。心室重構(gòu)是心臟為了維持正常的心排血量，心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化來適應(yīng)心臟血流動力學(xué)的改變，最終引發(fā)失代償性心力衰竭。心室重構(gòu)會引起神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中大量細胞因子的分泌異常，經(jīng)過一定時期的代償作用，導(dǎo)致心肌損傷加重，進而引起心功能惡化。另有研究表明神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的異?；顒樱瑢饳C體腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的異常運行。在心力衰竭時， RAAS等自分泌和旁分泌過度激活，表現(xiàn)為血漿 AngⅡ顯著升高，其短期效應(yīng)主要是血管收縮和正性肌力作用，但長期激活則表現(xiàn)為促生長作用，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)改變，是心室重構(gòu)的關(guān)鍵因素[7]。AngⅡ又是 RAAS中起關(guān)鍵作用的效應(yīng)肽，可以提高心室的前后負荷，促進成纖維細胞的增殖和膠原合成，并能引起心肌間質(zhì)纖維化和細胞凋亡。在RAAS異?；顒又?，醛固酮的大量分泌也會加重心肌細胞的損傷和心功能惡化，引起心室重構(gòu)[8]。所以，如果抑制AngⅡ的過度分泌，就能在一定程度上減慢或逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)過程，預(yù)防或延緩心力衰竭發(fā)病過程。除了AngⅡ，內(nèi)皮素(ET)也是心室重構(gòu)過程中的重要影響因素，ET是循環(huán)系統(tǒng)中內(nèi)皮細胞產(chǎn)生分泌的一種血管收縮肽，其主要活性成分是ET-1。在許多動物實驗和臨床研究中，都發(fā)現(xiàn)在CHF的發(fā)病過程中，對照組血漿中ET-1含量均低于實驗組，并證實ET含量的變化對心排血量、體循環(huán)和肺循環(huán)阻力以及心肌重構(gòu)、肥厚和纖維化有關(guān)[9]。ET-1含量的升高與CHF的預(yù)后情況有密切關(guān)系[10]。研究表明，CHF早期ET的縮血管作用可能是有益的，但隨著時間的推移，ET水平的升高，作用于心肌細胞和傳導(dǎo)系統(tǒng)造成心肌細胞內(nèi)堿化和原癌基因表達，活化磷酸肌醇系統(tǒng)，使心臟功能進一步惡化，它參與 CHF血流動力學(xué)紊亂和心肌損傷、心肌細胞肥大的病理過程，一定程度參與了心室重構(gòu)[11]。

BNP是由心肌細胞合成主要在心室內(nèi)表達的具有生物學(xué)活性的天然激素，它是體內(nèi)唯一的腎素-血管緊張素-醛固酮受體拮抗劑，BNP水平可反映心室的負荷程度，心室負荷輕度升高即可導(dǎo)致 BNP合成增加，可作為心室功能障礙的敏感指標。在CHF的進程中，BNP可抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性和腎素、醛固酮的釋放，通過提高腎小球濾過率來降低集合管對鈉的重吸收作用，促進鈉的排泄，抑制水鈉潴留；而BNP還具有抑制腎上腺素的作用，進一步減小肺動脈和血管的外周阻力，這樣不僅可以增加心臟的每搏輸出量，還能有效降低心臟的前后負荷，減少心肌細胞的能量消耗；此外，BNP可以抑制系膜細胞和纖維母細胞的增生過程，間接性地延緩心臟左室重構(gòu)[12]。

綜上所述，在CHF的早期階段，選擇性地針對神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)異?；顒舆M行調(diào)節(jié)，可以在一定程度上抑制相關(guān)系統(tǒng)激素和神經(jīng)因子的分泌水平，減慢心室重塑過程，延緩CHF發(fā)展。本實驗研究結(jié)果表明，苓桂術(shù)甘湯可以有效降低CHF模型大鼠血漿內(nèi)BNP、Ang Ⅱ和ET-1的含量。超聲心動圖檢測結(jié)果顯示，苓桂術(shù)甘湯對于延緩CHF模型大鼠的心室重塑過程，改善心功能具有明顯的促進作用。根據(jù)心肌組織的處理結(jié)果得出，苓桂術(shù)甘湯可以改善受損的心肌細胞結(jié)構(gòu)，從而改善心功能。這對于目前的臨床治療方法可以提供一定的補充和參考意義。但由于中醫(yī)方藥是復(fù)方治療，其中的藥物成分種類多樣，經(jīng)過多種途徑作用于多個靶點，從整體上調(diào)節(jié)機體的功能改善，其內(nèi)部作用機制相對復(fù)雜。因此，苓桂術(shù)甘湯的具體作用機制仍有待進一步研究。