電針后血清干預(yù)對多裂肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、Collagen I及MMP2表達(dá)的影響＊

陳玉佩，李曉紅，許 玥，徐 菁，霍則軍，張 莉

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029；2. 北京市豐臺區(qū)南苑醫(yī)院針灸按摩科 北京 100076；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100029；4. 北京大學(xué)第三醫(yī)院中醫(yī)科 北京 100191）

腰部多裂肌是穩(wěn)定腰椎的鋼索，多裂肌形態(tài)的改變和功能的紊亂是腰痛的重要誘因[1-2]。骨骼肌受損原因不盡相同，但其再生修復(fù)過程基本一致[3]，是肌纖維再生和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）重塑協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的結(jié)果[4]。ECM 既可以減輕炎癥反應(yīng)，又可以調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞（muscle satellite cell，MSCs）的生長環(huán)境，促進(jìn)骨骼肌的再生修復(fù)進(jìn)程[5]。MSCs 是骨骼肌組織的干細(xì)胞，它的激活、增殖是受損骨骼肌再生修復(fù)的前提條件[6]。

ECM 是存在于細(xì)胞間的結(jié)締組織，是構(gòu)成細(xì)胞物理結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)細(xì)胞間生物化學(xué)和生物力學(xué)信號的重要媒介，約占人體骨骼肌組織重量的10%，也是維持骨骼肌生理功能的關(guān)鍵，使骨骼肌能夠應(yīng)對內(nèi)、外環(huán)境的變化[7]。由此可見，ECM 對骨骼肌生理功能的維持和病理變化的改善具有重要作用[8]。針刺治療腰痛療效顯著，但其機制尚不十分明確。本課題組前期圍繞電針“委中”穴促進(jìn)損傷多裂肌再生修復(fù)的機制做了大量動物實驗，發(fā)現(xiàn)電針“委中”干預(yù)后血清中磷酸肌酸激酶和白介素17 發(fā)生明顯變化[9-10]。因此，本研究以離體培養(yǎng)的腰多裂肌MSCs 為研究對象、以電針“委中”穴后的血清為干預(yù)手段，觀察MSCs 的增殖情況和ECM組成成分—Collagen I、MMP2蛋白表達(dá)的變化，揭示電針治療腰多裂肌損傷的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

準(zhǔn)備25 只SPF 級雄性SD 大鼠，體重120 ± 10g ，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。許可證編號：SCXK（京）2016-0001）。于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障式實驗動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，室溫24℃，相對濕度為40%-50%。實驗過程中對動物的處置符合科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

采用隨機數(shù)字表法將其中24只大鼠分為正常組、模型組、電針組，每組8 只。（注：研究發(fā)現(xiàn)生理鹽水注射的對照組與正常組之間無統(tǒng)計學(xué)差異[10-11]，故本研究未設(shè)模型對照組。）

1.2 主要試劑及儀器

實驗的主要試劑及儀器為：布比卡因鹽酸鹽（BPVC（B5274-1G），SIGMA)；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Hyclone）；兔來源Collagen I 多克隆抗體（ab34710）；兔來源MMP2 多克隆抗體（10375-2-AP）；鼠單克隆抗體MyoD（ab16148）；兔來源Pax7 多克隆抗體（AF7584）；鼠多抗GAPDH 抗體、HRP山羊抗兔/鼠二抗、BCA蛋白定量檢測試劑盒、DAPI 染色液（北京索萊寶科技有限公司）；Bio-Rad?蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（BIO-RAD 公司）；華佗牌針灸針（0.30 mm×13mm，蘇州醫(yī)療用品廠）。

1.3 方法

1.3.1 造模方法

采用單次肌肉注射0.5%的布比卡因建立大鼠腰多裂肌損傷模型。具體制備方法參照已發(fā)表文章[12]。如圖1所示。

1.3.2 處理方法

各組的具體處理方法如下：

正常組：與模型組同步抓取、固定、取材，但不造模、予電針治療。

模型組：與電針組同步抓取、固定、取材，但不予電針治療。

電針組：造模后24 h，以《實驗針灸學(xué)》[13]實驗動物穴位圖譜為依據(jù)，取雙側(cè)“委中”穴（膝關(guān)節(jié)背面正中）進(jìn)行電針治療，造模后第4 d 取材。電針方法：將大鼠置于固定器上，暴露雙后肢。華佗牌針灸針（0.30 ×13 mm）直刺進(jìn)針約0.5～1 cm，連接韓式電針儀(HANS-200 A)，2/100 Hz 疏密波，1-2 mA 電流強度，20 min/次，1次/d，共3次。

1.3.3 制備針刺血清

造模后的第4 d，10%水合氯醛腹腔注射（350 mg/kg）麻醉，腹主動脈取血5 ml，室溫靜置2 h，3500 r/min離心10 min，取上清，56℃滅活30 min，無菌條件下經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 原代MSCs的分離、培養(yǎng)、純化

結(jié)合Ⅰ型膠原酶消化法和差速貼壁法獲取大鼠腰4-5 節(jié)段多裂肌MSCs。具體多裂肌MSCs 分離、培養(yǎng)、純化方法參照已發(fā)表文章[14]。

1.3.5 MSCs的鑒定

取第4 代MSCs，以2×104個/孔細(xì)胞數(shù)接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)24 h 檢測Pax7 的表達(dá)，培養(yǎng)72 h檢測MyoD的表達(dá)。細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3次×5 min，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 次× 5 min；0.5%Triton X-100 破膜10min，PBS 清洗3 次× 5 min；5%山羊血清封閉1 h，PBS 清洗3 次× 5 min；加1∶100 稀釋的一抗，4℃過夜；吸出一抗，PBS 清洗3 次×5 min，加入1∶100 稀釋的FITC 標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG，37℃避光孵育1 h，PBS 清洗3 次×5 min；加入1∶1000 稀釋的DAPI 染核5 min；PBS 清洗1 次，熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍照。細(xì)胞鑒定過程重復(fù)3次。

1.3.6 指標(biāo)檢測

CCK-8（Cell Counting kit-8）檢 測 各 組 血 清 對MSCs 增殖的影響：將細(xì)胞稀釋成2×105個/mL，以2×104個/孔細(xì)胞懸液接種到96 孔板中。隨機分為空白組、正常血清組、模型血清組、電針血清組，每組重復(fù)6孔。培養(yǎng)24 h后，空白組加入DMEM培養(yǎng)基，25 μl/孔；其余各組分別加入對應(yīng)的正常血清、模型血清、電針血清，25 μl/孔。培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8溶液，10 μl/孔。培養(yǎng)1 h 后，酶標(biāo)儀（450 nm 波長）測定各孔平均吸光度（OD）值。CCK-8實驗重復(fù)3次。

WB 檢測Collagen I、MMP2 蛋白表達(dá)：①將細(xì)胞稀釋成2×105個/mL，以1×106/皿接種細(xì)胞，隨機分為正常血清組、模型血清組、電針血清組，培養(yǎng)24 h；②棄培養(yǎng)基，加入無血清DMEM 培養(yǎng)基同步化處理24 h；③棄培養(yǎng)基，每皿對應(yīng)加入含相應(yīng)血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；④提取總蛋白并測定蛋白濃度，蛋白變性后，以50 μg/孔蛋白上樣。

WB 操作步驟同已發(fā)表文章所述[15]。以GAPDH作為內(nèi)參對照，計算每個樣本的Collagen I、MMP2 與GAPDH的光密度比值(IDV)。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。服從正態(tài)分布，方差齊，組間采用單因素方差分析（one-Way ANONA），兩兩比較用LSD-t 檢驗，不服從正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

表1 各組血清對MSCs增殖的影響(±s)

表1 各組血清對MSCs增殖的影響(±s)

分組空白組正常血清組模型血清組電針血清組N 6666 OD值0.258±0.0031.659±0.113*1.821±0.074*※2.303±0.201*※※▲

2.1 MSCs形態(tài)特征及免疫熒光染色鑒定

由圖2 可知，分離培養(yǎng)2d 的細(xì)胞呈折光性較強的球形，但貼壁數(shù)量少；隨著時間培養(yǎng)時間的推移，貼壁細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮突蚣忓N形。由圖3 免疫熒光染色結(jié)果可知，Pax7、MyoD 在細(xì)胞增殖過程中呈胞核表達(dá)陽性。具體見圖2、圖3。

圖3 MSCs不同時期Pax7、MyoD免疫熒光染色觀察

2.2 CCK-8檢測各組血清對MSCs增殖的影響

與空白組比較，正常血清組模型血清組、電針血清組OD 值明顯增加（P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01）；與正常血清組比較，模型血清組、電針血清組OD 值升高（P＜0.05、P＜0.01）；與模型血清組比較，電針血清組OD值升高（P＜0.01）。見表1、圖4。

2.3 電針血清對Collagen I、MMP2蛋白的表達(dá)的影響

與正常血清組比較，模型血清組Collagen I、MMP2蛋白表達(dá)升高（P＜0.01、P＜0.05），電針血清組Collagen I、MMP2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01、P＜0.01）；與模型血清組比較，電針血清組Collagen I蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）、MMP2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。見表2、圖5、附圖1。

3 討論

針刺作為腰痛行之有效的治療方法，在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用和認(rèn)可[16-17],這可能與針刺改善局部微循環(huán)，提高自由基活性，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子分泌有關(guān)。多裂肌與腰痛發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，但卻很少受關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺可顯著改善腰多裂肌損傷大鼠IGF1R、ERK、PI3K/Akt/mTOR 等多種細(xì)胞因子和信號通路的表達(dá)[18-20]。由于難以克服在體實驗多因素的影響，其具體機制尚不十分明確，因此本實驗采用電針血清作為干預(yù)手段，觀察大鼠腰多裂肌MSCs增殖情況及ECM中Collagen I、MMP2表達(dá)量的變化，從血清學(xué)角度探究針刺治療腰痛的部分作用機制。

圖4 CCK-8檢測各組血清對MSCs增殖的影響

表2 各組血清對MSCs中Collagen I、MMP2蛋白表達(dá)的影響(±s)(單位：光密度比值)

表2 各組血清對MSCs中Collagen I、MMP2蛋白表達(dá)的影響(±s)(單位：光密度比值)

分組正常血清組模型血清組電針血清組Collagen I 0.223±0.0220.356±0.023**0.261±0.007**※MMP20.566±0.0370.613±0.014*0.738±0.043**※

圖5 WB檢測各組MSCs中Collagen I、MMP2蛋白表達(dá)水平

附圖1 各組Collagen I、MMP2蛋白表達(dá)條帶圖

MSCs 和鄰近其他細(xì)胞共同參與完成骨骼肌損傷后的再生修復(fù)[21-22]，其中ECM 為MSCs提供結(jié)構(gòu)支架和信號傳遞，通過信號傳導(dǎo)系統(tǒng)直接影響MSCs 的激活、增殖、分化，調(diào)控骨骼肌重塑功能的正常發(fā)揮。由此可見，ECM 可能對損傷多裂肌的再生修復(fù)發(fā)揮重要作用。目前，針刺治療骨骼肌損傷的研究集中于觀察MSCs的自身變化，而忽視了ECM 對MSCs影響的重要性。因此，本研究著重從血清學(xué)角度觀察電針后，血清干預(yù)對多裂肌MSCs增殖及ECM相關(guān)成分的影響。

ECM 是由Collagen、層粘連蛋白和蛋白聚糖等大分子物質(zhì)組成的動態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為ECM 的沉積、重構(gòu)和降解等[23-24]。其中Collagen I的沉積是導(dǎo)致骨骼肌纖維化的主要原因[25]，也是形成膠原纖維并發(fā)揮作用的前提條件[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，針刺可能通過抑制Collagen I 的含量減輕纖維化程度[27]。通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，針刺可以減輕損傷骨骼肌中膠原纖維的沉積和增生程度[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)由于電針后血清的干預(yù)，ECM 中Collagen I 含量下降；CCK-8 結(jié)果表明MSCs 增殖能力提高，表明針刺可能通過抑制Collagen I的表達(dá)促進(jìn)MSCs的增殖。

MMPs（Matrix Metalloproteinases,MMPs）可以降解ECM 中膠原的沉積，與骨骼肌再生、肌纖維增殖和ECM 重建關(guān)系密切[30-31]。骨骼肌再生修復(fù)過程中MMP2 含量增加[32-33]。MMP2 含量的增加、Collagen I 的減少可能是肝纖維化程度減輕的原因[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，電針后血清干預(yù)使MMP2 含量增加，Collagen I 表達(dá)下降，這可能是腰多裂肌MSCs 增殖的原因。由此可知，電針“委中”穴可能通過調(diào)節(jié)ECM 中與骨骼肌纖維化有關(guān)的Collagen I、MMP2 的蛋白表達(dá)，加快MSCs的增殖速度，促進(jìn)損傷多裂肌的再生修復(fù)，但電針“委中”穴是通過血清中的哪些成份發(fā)揮對多裂肌再生修復(fù)的良性調(diào)節(jié)作用，仍需進(jìn)一步的深入研究，這可能是揭示電針促進(jìn)骨骼肌再生修復(fù)機制的關(guān)鍵所在。