參苓白術(shù)散合麥門冬湯對染矽塵肺纖維化（肺脾兩虛型）大鼠肺組織細胞HMGB1、PDGF的影響＊

黃 高，曹繼剛，何光志，楊光勇，楊長福，王寬琴，陳 永

（1. 湖北中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 武漢 430065；2. 貴州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 貴陽 550025）

矽肺(silicosis)是由于機體長期吸入含二氧化硅（SiO2）粉塵等物質(zhì)而引起的以肺間質(zhì)纖維化為主要特征的全身性疾病。矽肺是我國最常見的職業(yè)病之一，迄今仍缺乏有效的治療手段。雖然目前對矽肺的發(fā)病機制的研究眾多，但尚未完全探明，高遷移率族蛋白B1(HMGB1)在多個臟器炎性反應及纖維化過程中起到關(guān)鍵作用，成為目前醫(yī)學研究的熱點[1]。Zhang L等[2]利用原兒茶醛（PA）調(diào)節(jié)HMGB1/RAGE 途徑來預防實驗性肺纖維化過程中，研究發(fā)現(xiàn)PDGF 表達可通過減少HMGB1 的調(diào)節(jié)而降低，由此說明HMGB1 與PDGF 之間呈在密切關(guān)聯(lián)。中醫(yī)臨床普遍認為，矽肺肺纖維化基本病機是本虛標實。本虛即正氣虛,前期主要以脾肺氣陰兩虛為主，后期在脾肺氣陰兩虛基礎(chǔ)上，表現(xiàn)為腎陽虛。標實是瘀血、痰濁阻滯肺絡[3]。

本研究根據(jù)矽肺患者的病因病機，通過辨證論治，收集中醫(yī)多年來治療矽肺患者的臨床資料，以及在貴州省中醫(yī)院（貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院）、貴州省職業(yè)病防治院（貴州省第三人民醫(yī)院）已取得的臨床效果發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥防治矽肺或肺間質(zhì)纖維化能緩解疾病癥狀、修復損傷、調(diào)節(jié)免疫、限制炎癥、恢復肺功能、改善血液流變及延緩病情進展等。針對已診治該病肺脾兩虛型患者有效經(jīng)驗顯示在選方用藥時應多使用益肺健脾，祛痰活絡藥物，善用培土生金之法，其中人參、麥門冬、黃芪、白術(shù)、茯苓、山藥、半夏、丹參等為常選藥物，故選取參苓白術(shù)散合麥門冬湯加減方（人參、麥門冬、黃芪、白術(shù)、茯苓、白扁豆、薏苡仁、山藥、砂仁、半夏、丹參、三七、甘草）高、中、低三種不同劑量，對染矽塵肺纖維化肺脾兩虛大鼠動物模型進行治療，觀察各組實驗動物肺組織細胞HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 含量及基因表達的變化，探討HMGB1與PDGF 信號通路之間的關(guān)系，以期明確本方法在治療矽肺肺纖維化過程中的作用機制是否與調(diào)控HMGB1、PDGF等因素有關(guān)。

1 材料與主要儀器

1.1 動物

健康SD 大鼠，SPF 級，體重220～230 g，雌雄各半，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（湘）2014-0011]，實驗過程嚴格遵守國家《實驗動物管理條例》和2006年科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》，符合中國倫理委員會相關(guān)動物研究指導原則。

1.2 試劑

本實驗所用的中藥由貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院提供；醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H33021207）；二氧化硅晶體標準品（Sigma，純度99%，粒子直徑為0.5～10 μm,并且80%在1～5 μm間）；北京百泰克生物技術(shù)有限公司提供的2×TaqPCR Master Mix（Lot：#P5103）、DNA Marker DL2000（Lot：#B021003018）；高純總RNA 快速抽提試劑盒（生產(chǎn)批號：B012005018）；逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（THERMO,Lot：00365247）；Rat HMGB-1 Elisa kit（Andy gene, Lot:AD20180601）；Rat IL-6 Elisa kit（Andy gene, Lot:AD20180601）；Rat PDGF Elisa kit（Andy gene, Lot:AD20180806）；Rat K-RAS Elisa kit（Andy gene,Lot:AD20180806）；HE 染 色 試 劑 盒（Solarbio, Lot：NO.20160808）。

1.3 主要儀器

超微量全波長酶標儀（美國，Multisksn Go）；顯微鏡攝像CCD 照相系統(tǒng)（日本，DP73+standard1.6）；超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDoc XRS+（美國，Bio-Rad）;C1000 Touch ?96 孔 快 速PCR 儀（美 國，Bio-Rad）;PowerPac?HC 高電流電泳儀（美國，Bio-Rad）；超低溫冰箱（美國，Thermo Scientific Revco PLUS 新型-86℃）；低溫高速離心機（德國，Hettich）；控溫水浴搖床（美國，F(xiàn)ORMA）。

2 方法

2.1 實驗分組與給藥

按照大黃煎液灌服脾虛造模法[4]和《實驗動物學教程》（2009年1月第1 版）“矽肺動物模型”方法[5]，選用清潔級SD 大鼠57 只（造模死亡與確定模型成功9只），隨機分為對照組和造模組。對照組每日1次生理鹽水灌胃（1 g/mL，12 g/kg），造模組采用隔日饑飽失常加每日1 次大黃水煎液灌胃（大黃生藥含量為1 g/mL，12 g/kg），脾虛證造模30 d。停止灌胃2 d后，各組大鼠10%水合氯醛麻醉，氣管注入1 mL 各實驗用液體，立即將大鼠頭部抬起直至大鼠完全直立，讓實驗用液體在兩肺均勻分布。對照組注入滅菌生理鹽水，造模組給予50 mg/mL SiO2粉塵懸液，30 d 后。待造模成功，造模組隨機分為肺脾兩虛模型組、激素組、中藥高劑量組、中藥中劑量組和中藥低劑量組，每組8只。激素組給予35%醋酸潑尼松溶液0.01 mL/g[6]，中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組每天分別給予0.01 mL/g（含生藥7 g/kg）、0.01 mL/g（含生藥14 g/kg）、0.01 mL/g（含生藥28 g/kg）中藥灌胃，每周7次[7]。對照組和染矽塵組給予等體積的生理鹽水灌胃，各組動物于造模成功后30 d處死。

2.2 動物處理及標本采集

造模30 d 后，隨機取模型組大鼠肺組織HE 染色。治療組治療結(jié)束后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（按0.0035 mL/g）麻醉，取大鼠肺組織-80℃儲藏備用。

2.3 測試指標

2.3.1 HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS含量ELISA檢測

(1) 標準品加樣在酶標包被板（以下簡稱“板”）上選10個孔加標準品，并將其分為5組，每組加2個濃度相同標準品，每孔50 μL,濃度分別為：12 μg/L、8 μg/L、4 μg/L、2 μg/L、1 μg/L（HMGB-1）；120 ng/L、80 ng/L、40 ng/L、20 ng/L、10 ng/L(IL-6)；36 ng/L、24 ng/L、12 ng/L、6 ng/L、3 ng/L(PDGF)；120 ng/L、80 ng/L、40 ng/L、20 ng/L、10 ng/L（K-RAS）。

(2) 加樣設空白孔、檢測品孔，在板上樣品孔中加樣品稀釋液40 μL,再加檢測品10 μL，搖勻。

(3) 溫箱培育與清洗封板后，在37℃溫箱培育35 min。倒掉液體，各孔加200 μL清洗液，放置半分鐘后倒掉，反復5次。

(4) 加酶標劑除空白孔外，各孔加酶標劑50 μL。

(5) 重復溫箱培育和清洗倒掉液體，各孔加200 μL清洗液，放置半分鐘后倒掉，反復5次。

(6) 各孔顯色各孔分別加顯色劑A 和B各50 μL，搖勻，在37℃溫箱中，避光溫育15 min。

(7) 檢測450 nm波長檢測各孔吸光度（OD值）。

2.3.2 HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS RT-PCR檢測

首先將待測肺組織樣品從-80℃超低溫冰箱取出，按高純總RNA 抽提試劑盒要求進行抽提總RAN，在分光光度計上于280 nm 及260 nm 處測量吸光度。以總RAN 為模板通過Oligo（dT）18 為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

HMGB1-Forward:5′-GATGACAAGCAGCCCTAT-3′,Reverse：5′-TCCATGCCAATTTACAAC-3′，擴 增 片段 長 度481 bp[8]；IL-6-Forward：5′-ATTTATGAACAGCGATGATGCAC-3′，Reverse：5′-CCAGGTAGAAACGGAACTCCAGA-3′，擴增片段長度150bp[9]；PDGFForward：5′-TGTTCCCCTCGTCCGTCTGTC-3，Reverse：5′-CTGGAGTGGAGTCCTTCCTTTGCT-3′，擴 增 片 段長度139 bp[10]；K-ras-Forward：5′-TTCTTTGTGTATTTGCC-3′；Reverse：5′-GAGCCTGTTTCGTGTCT-3′，擴增片段長度159 bp[11]。GAPDH-Forward：5′-AAGGAGGCAAAGGACACCAA-3′；Reverse：5′-AATGGCCCCCTTCACAGTTA-3′，擴增片段長度203 bp[12]；引物序列由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。

PCR 反應程序：變性95℃5 min，95℃35 sec，退火60℃35 sec，延 伸72℃35 sec，36 Cycle，溫 育72℃15 min。采用PCR 檢測各組肺組織中基因HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 表達影響。采用25 μL 反應體系，PCR 反應體系為：2×TaqPCR Master Mix:12.5 μL；cDNA 產(chǎn)物：1.5 μL；無菌水：9.5 μL，上下游引物各0.75 μL。擴增產(chǎn)物在1.3%瓊脂糖凝膠上電泳，用Bio-RadQuantity One 軟件對電泳條帶進行掃描和光密度分析。

2.4 計算與統(tǒng)計學處理

ELISA 檢測等到OD 值后，采用CurveExpert V1.4版計算各指標含量，計算HMGB-1 含量，方程名稱為Logistic 模 型:y = a/(1 + be-cx)（Coefficient Data:a =1.20189620628E + 001；b =1.04590763476E + 001；c =8.82891298157E + 000）；計算IL-6 含量，方程名稱為3rd degree Polynomial Fit:y = a + bx+cx2+dx3...（Coefficient Data:a =-1.03303179300E - 001；b =2.02756014563E +002；c =-2.57552278630E + 002；d =2.10792982106E +002）；計算PDGF 含量，方程名稱為修正Hoerl模型:y=ab1/xxc（Coefficient Data:a =4.03090694111E + 001；b =9.97501311334E - 001；c =3.53171007068E - 001）；計算K-RAS 含量，方程名稱為有理函數(shù):y=(a+bx)/(1+cx + dx2)(Coefficient Data:a=-2.92185647887E + 001；b=7.35851897803E+003；c=8.95821668939E+001；d=-3.86914666422E+001）。

所有結(jié)果均以平均數(shù)標準差表示，用SPSS 21.0軟件進行方差分析P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 確定染矽塵肺纖維化（肺脾兩虛）模型建立

3.1.1 一般情況

染矽塵肺纖維化（肺脾兩虛）模型建立后，正常對照組：大鼠形體正常，姿勢舒展，反應敏捷，活動自如，毛發(fā)光澤，飲食良好，糞便成型，且干濕合適，體重增加，呼吸均勻；模型組：大鼠長期倦臥、精神萎靡、形體消瘦、反應遲緩、毛發(fā)暗淡無光澤，飲食量減少，大便稀溏量多，呼吸急促。經(jīng)過各藥物治療后，治療各組大鼠與模型組比較，癥狀均有相應改善，精神明顯好轉(zhuǎn)，體重增加，反應尚靈敏，毛發(fā)欠光澤，飲食量尚可，大便成形，呼吸稍勻稱，伴有輕度咳喘。與對照組比較，肺脾兩虛模型組大鼠體重減輕。各治療組體重均較肺脾兩虛模型組升高，但較對照組低（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較(±s, n = 8)

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較(±s, n = 8)

注：*與對照組比較P＜0.05，＃與肺脾兩虛模型組比較P＜0.05

對照組肺脾兩虛模型組激素組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組體質(zhì)量/g 278±36.72＃204±22.54*236±28.37*＃247±19.63*＃232±21.32*＃227±27.65*＃

3.1.2 染矽塵肺纖維化（肺脾兩虛）模型肺組織切片

染矽塵肺纖維化（肺脾兩虛）模型建立后，隨機選取正常對照組和肺脾兩虛造模組，共4只大鼠[7]。分別取肺組織進行HE 染色，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，肺脾兩虛造模組大鼠肺組織中肺泡間隔、支氣管管壁等處纖維成分顯劇增多,并形成明顯的矽結(jié)節(jié)，造模組大鼠肺組織可見肺間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等明顯增多，膠原組織沉積，肺泡腔大小不均，肺泡壁變厚，纖維結(jié)締組織增加，提示矽肺大鼠模型造模成功（見圖1）。

圖1 染矽塵大鼠肺組織中病理切片觀察

表2 各組大鼠肺組織HMGB1、IL-6、PDGF、RAS含量變化(±s, n = 8)

表2 各組大鼠肺組織HMGB1、IL-6、PDGF、RAS含量變化(±s, n = 8)

注：*與對照組比較P＜0.05，＃與肺脾兩虛模型組比較P＜0.05

對照組肺脾兩虛模型組激素組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組HMGB1/μg·L-1 12.24±1.46＃55.16±6.87*IL-6/ng·L-1 113.77±13.38＃304.18±15.64*PDGF/ng·L-1 77.29±6.60＃123.68±11.95*K-RAS/ng·L-1 304.97±20.17＃404.19±29.35*18.28±2.14*＃156.10±12.62*＃96.02±7.63*＃348.32±32.25*＃18.12±1.98*＃155.39±14.50*＃92.58±8.42*＃345.75±32.96*＃19.03±2.23*＃161.53±13.86*＃98.68±6.71*＃364.84±30.40*＃387.35±31.77*＃28.02±3.72*＃210.16±12.95*＃111.52±10.18*＃

3.2 各組肺組織中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 蛋白含量變化

研究發(fā)現(xiàn)肺脾兩虛模型組肺組織中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 含量明顯高于對照組（P＜0.05）。經(jīng)過激素或中藥治療后，治療各組肺組織中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 含量明顯低于染矽塵組（P＜0.05），但都低于對照組（P＜0.05）。數(shù)據(jù)分析表明，中藥低劑量組肺組織中各項指標均高于其他各治療組（P＜0.05）；激素組和中藥中、高劑量組肺組織中HMGB1、IL-6 的含量無顯著差異（P＜0.05）；中藥高劑量組肺組織中PDGF 含量明顯低于激素組和中藥中劑量組（P＜0.05），而激素組和中藥中劑量組之間無顯著差異（P＜0.05）；中藥中劑量組肺組織中K-RAS 含量明顯高于激素組和中藥高劑量組（P＜0.05），而激素組和中藥高劑量組之間無顯著差異（P＜0.05）。這說明經(jīng)過激素和中藥治療后，藥物對染矽塵大鼠肺組織中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS含量有降低作用，中藥各組對降低染矽塵肺纖維化大鼠（肺脾兩虛）肺組織HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS蛋白含量有一定效果，其中中藥中劑量和中藥高劑量組效果較好，見表2。

3.3 HMGB1、IL-6、PDGF、RAS基因表達檢測

經(jīng)過RT-PCR擴增，與對照組肺組織比較，發(fā)現(xiàn)肺脾兩虛模型組、激素組、中藥高、中、低劑量組肺組織HMGB1mRNA、IL-6mRNA、PDGFmRNA、K-RASmRNA表達明顯高于對照組（P＜0.05），肺脾兩虛模型組肺組 織 HMGB1mRNA、IL-6mRNA、PDGFmRNA、KRASmRNA表達明顯高于其他各治療組（P＞0.05）。在治療組中，中藥高劑量組HMGB1mRNA、PDGFmRNA、K-RASmRNA 表達明顯低于與其他各治療組（P＞0.05），中藥中劑量組與激素組之間無顯著差異（P＞0.05）；中藥高劑量IL-6mRNA 與激素組之間無顯著差異（P＞0.05），但都低于中藥中劑量組；中藥低劑量組各指標表達均高于其他各治療組（P＞0.05）。由此顯示，經(jīng)過激素和不同劑量中藥治療后，治療藥物對染矽塵肺纖維化（肺脾兩虛）大鼠肺組織HMGB1mRNA、IL-6mRNA、PDGFmRNA、K-RASmRNA 表達有一定抑制作用，但中藥高劑量降低染矽塵大鼠肺組織HMGB1mRNA、IL-6mRNA、PDGFmRNA、K-RASmRNA表達較明顯，具體結(jié)果見圖2、表3。

圖2 RT-PCR擴增各組大鼠HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

表3 各組大鼠肺組織HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS基因表達變化(±s, n = 8)

表3 各組大鼠肺組織HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS基因表達變化(±s, n = 8)

注：*與對照組比較P＜0.05，＃與肺脾兩虛模型組比較P＜0.05

K-RAS 11.114±0.93＃36.62±1.06*20.57±0.65*＃17.33±0.78*＃20.09±0.47*＃24.99±0.90*＃對照組肺脾兩虛模型組激素組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組HMGB117.04±0.94＃40.44±1.29*28.61±1.06*＃25.96±0.90*＃28.70±1.09*＃34.37±1.11*＃IL-628.45±1.17＃54.04±1.30*38.76±1.03*＃38.31±1.14*＃42.38±0.51*＃46.60±0.80*＃PDGF 20.13±0.79＃41.97±1.04*27.18±0.77*＃24.67±0.62*＃27.05±0.44*＃33.82±0.98*＃

4 討論

本研究采用脾虛模型和矽肺肺纖維化模型相結(jié)合，模擬染矽塵肺纖維化早中期肺脾氣陰兩虛證型。結(jié)合《內(nèi)經(jīng)》中“皆聚于胃，關(guān)于肺”和《難經(jīng)·六十九難》中“虛則補其母”等中醫(yī)基礎(chǔ)理論與臨床實驗經(jīng)驗，遴選中醫(yī)培土生金法的代表方“參苓白術(shù)散”合“麥門冬湯”為基礎(chǔ)方，加入活血藥物組成。其中“參苓白術(shù)散”源于《古今醫(yī)鑒》，功用為益氣健脾，和胃滲濕，保肺(培土生金)?！胞滈T冬湯”源于《金匱要略》，功用為清養(yǎng)肺胃，降逆下氣。兩方合用健脾保肺，生津斂陰，治脾虛久咳肺虛，氣陰兩傷。兩方中以人參、白術(shù)、茯苓、甘草(即四君子湯)平補脾胃之氣，為主藥。以白扁豆、薏苡仁、山藥之甘淡，助白術(shù)既可健脾，又可補肺滲濕化痰，為輔藥。以砂仁芳香醒脾，促中州運化，通上下氣機為佐藥。桔梗為太陰肺經(jīng)的引經(jīng)藥，其作用如舟車載藥上行，達上焦以益肺氣。麥門冬甘寒養(yǎng)陰清熱，潤肺生津；半夏降逆化痰；加用黃芪補脾益肺，丹參、三七活血、涼血、安神；此方應用培土生金之法，對肺脾氣陰兩虛，久咳痰多者，效果較好。陳茂剛[13]運用參苓白術(shù)散治療肺纖維化（肺脾氣虛型）患者，能改善癥狀、增強機體免疫功能、有效抑制機體炎癥反應。孫杰等[14]應用參苓白術(shù)散治療慢性阻塞性肺疾病（肺脾兩虛型）模型大鼠能顯劇下調(diào)血清IL-1等炎癥因子水平。劉建軍等[15]發(fā)現(xiàn)，麥門冬湯能抑制放射性肺纖維化大鼠肺組織IL-1 和NF-KB 蛋白表達等。由此探討參苓白術(shù)散合麥門冬湯對染矽塵肺纖維化（肺脾兩虛型）大鼠肺組織細胞HMGB1、PDGF 的影響。采用大黃煎液灌服脾虛造模法，可能會出現(xiàn)大黃中、大黃素等成分通過血液吸收對肺纖維化形成有一定影響，但朱曼[4]、張偉[16]等前期脾虛復合肺纖維化模型顯示大黃所含成分對肺纖維化的形成無影響。

HMGB1 是存在于哺乳動物細胞核中的一類非組蛋白，其可作用靶細胞表面受體，激活相關(guān)信號通路，刺激大量炎性因子的釋放，放大和延長炎癥反應,從而促進纖維細胞的增生、膠原沉積以及纖維結(jié)節(jié)的形成[11]。HMGB1能刺激巨噬細胞等單核細胞分泌的IL-6[17-18]，HMGB1 含量越多，單核細胞分泌IL-6 的量就越多。肺組織中血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和巨噬細胞均可產(chǎn)生PDGF。研究表明，PDGF 與其受體結(jié)合后，導致該受體的胞內(nèi)酪氨酸產(chǎn)生自主磷酸化，磷酸化酪氨酸與胞膜上的PDGF 受體結(jié)合蛋白2（Grb2）相結(jié)合，Grb2 又與鳥嘌呤核苷酸交換因子SOS結(jié)合，參與激活Ras，引起成纖維細胞增生[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，染矽塵肺纖維化肺脾兩虛大鼠肺組織中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS含量明顯升高，通過不同含量中藥治療后，大鼠肺組織中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 含量明顯下降，既證明中藥的效果，中藥有下調(diào)這些蛋白的作用，又說明HMGB1與PDGF 之間存在正相關(guān)關(guān)系。

本研究遴選中醫(yī)培土生金法的代表方“參苓白術(shù)散”合“麥門冬湯”加減灌胃治療染矽塵肺纖維化肺脾兩虛型大鼠，對對照組、肺脾兩虛模型組、激素組和中藥治療各組大鼠治療前后大鼠肺組織HMGB1、IL-6、PDGF、K-Ras 蛋白含量，基因表達水平作用的影響改變，從證候?qū)嵸|(zhì)研究角度，既揭示PDGF/Ras 信號轉(zhuǎn)導通路過度激活是染矽塵大鼠肺纖維化形成的主要機制，又提示HMGB1 可能激活PDGF/Ras 信號轉(zhuǎn)導通路，促進肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究利用中醫(yī)培土生金法能起到抑制矽肺肺纖維化（肺脾兩虛型）HMGB1/PDGF/Ras 信號轉(zhuǎn)導通路的作用，為優(yōu)化中醫(yī)藥防治該疾病提供思路，又驗證了中醫(yī)五行相生理論“培土生金法”對中醫(yī)臨床與科研的指導意義。