不同雜柑皮與多種陳皮揮發(fā)油對比分析研究＊

盛永成，唐 飛，王 晶，張世洋，馮五文，敖 慧，饒朝龍

（成都中醫(yī)藥大學(xué)/中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地/中藥材標準化省部共建教育部重點實驗室 成都 611137）

陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效[1]?，F(xiàn)陳皮藥材商品規(guī)格有“廣陳皮”和“陳皮”之分，廣陳皮來源于茶枝柑（Citrus reticulata‘Chachi'），主要分布在廣州新會，而歷來陳皮藥材的原植物有福橘（Citrus reticulata‘Tangerira'）、大紅袍（Citrus reticulata‘Dahongpao'）、溫 州 蜜 桔（Citrus reticulata‘Unshiu'）、南豐蜜桔、茶枝柑等，在全國各地均有分布。

近年來，隨著農(nóng)業(yè)技術(shù)的不斷發(fā)展，柑橘市場上出現(xiàn)了大量味道鮮美的雜柑品種，即雜交的橘柚、橘橙、橙柚等品種，以及其與橘、橙、柚類回交或復(fù)交而獲得的品種。這些品種均是21世紀柑橘的主流品種，如不知火（Tacopon）、清見（Kiyomi tangor）、臺灣茂谷柑（Murcott）等，因其具備較好的食用價值和經(jīng)濟效益，深受廣大群眾和果農(nóng)的歡迎。隨著柑橘品種的不斷推陳出新，這些雜柑皮外形雖與傳統(tǒng)陳皮較為類似，但藥用質(zhì)量未進行評價，特別是切絲后在市場流通并混雜入藥，致使陳皮藥材基原混亂，不僅給藥材的鑒定和質(zhì)量評價帶來了諸多困難，同時臨床療效也難以保障。

本課題組通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，快速、有效地對比分析雜柑皮與陳皮揮發(fā)油的化學(xué)組成和相對含量，為雜柑皮的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

儀器主要有：BS200S型精密電子天平（d=0.001 g，max 200 g），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），揮發(fā)油提取器（成都長征化玻有限公司），GC 5975C/MS 7890A 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國，Agilent公司）。

1.2 試藥

試藥有：正己烷（分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號：2016120201），無水硫酸鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20140114）。課題組采集（購）雜柑皮10個品種，陳皮12個品種，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳璐副教授鑒定確認。樣品采集信息見表1、表2。

表1 雜柑皮樣品信息

表2 陳皮樣品信息

1.3 供試液制備

將收集到的新鮮雜柑皮用電熱鼓風(fēng)干燥箱45 ℃干燥，持續(xù)干燥6 h，待返軟后再干燥2 h。之后，依次取粉碎后的雜柑皮、陳皮粗粉，30 g，加8 倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取2 h，收集各自揮發(fā)油。取各樣品揮發(fā)油10 μl，用正己烷溶解稀釋100 倍，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，0.22 μm 微孔濾膜過濾后即為供試液。

1.4 GC-MS測定條件

HP-5MS 石英毛細管色譜柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；升溫程序為：初始溫度60 ℃，第1 階段以2 ℃/min 的速率上升到82 ℃；第2 階段以20 ℃/min 上升到144 ℃，保持3 min；第3 階段以8 ℃/min 上升到260 ℃，保持10 min；載氣為高純度He，載氣流量為1 ml/min，進樣量為1 μl，分流比10∶1。離子源為EI，電離電壓，進樣口溫度270 ℃，檢測器溫度270 ℃，質(zhì)量掃描范圍，m/z：30～550 amu，溶劑延遲4 min，質(zhì)譜檢索標準譜庫為NIST MS search 2.0。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0 進行統(tǒng)計分析。獨立樣本T 檢驗（Independent-Samples T Test）用于分析兩組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計學(xué)差異。如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則應(yīng)用曼-惠特尼U 檢驗（Mann-Whitney U Test）。所有數(shù)據(jù)均表示為“平均值± S.E.M”。P＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取結(jié)果

收集10個品種雜柑皮和12個品種陳皮揮發(fā)油，計算揮發(fā)油得率。計算公式：得率（%）=揮發(fā)油提取量（ml）/樣品質(zhì)量（g），結(jié)果見表3。

表3 揮發(fā)油提取結(jié)果

2.2 揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果

10個品種雜柑皮和12個品種陳皮揮發(fā)油經(jīng)計算機核對和質(zhì)譜解析共鑒定出52 種化合物（3個未鑒定出），其化合物的面積歸一值結(jié)果見表4，總離子流圖見圖1，各自共有成分的平均相對含量見表5。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 精密度試驗

取揮發(fā)油供試品（S1-S22），按1.4項下的條件，連續(xù)進樣6 次，測定，記錄其色譜圖，得到雜柑皮和陳皮揮發(fā)油共有峰相對保留時間并計算相對峰面積的RSD。α-蒎烯、檜烯、月桂烯、檸檬烯、芳樟醇、癸醛、2,2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）定量離子峰面積的RSD（n = 6）分別為2.2%、1.5%、0.69%、2.8%、1.0%、1.3%、2.2%，表明精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

取同一揮發(fā)油供試品（S1-S22），按1.4項下的條件，分別于0、2、4、8、12、18、24 h 時進樣，測定，記錄其色譜圖，得到雜柑皮和陳皮揮發(fā)油共有峰相對保留時間，并計算相對峰面積的RSD。α-蒎烯、檜烯、月桂烯、檸檬烯、芳樟醇、癸醛、2,2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）定量離子峰面積的RSD（n = 7）分別為3.2%、4.3%、2.0%、3.1%、2.1%、1.0%、4.7%，結(jié)果表明，供試品溶液24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗

按1.3項下的方法平行制備揮發(fā)油供試品（S1-S22）6 份，按1.4項下的條件分別進樣分析，記錄其色譜圖，得到雜柑皮和陳皮揮發(fā)油共有峰相對保留時間并計算相對峰面積的RSD。α-蒎烯、檜烯、月桂烯、檸檬烯、芳樟醇、癸醛、2,2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）定量離子峰面積的RSD（n=6）分別為1.8%、2.4%、2.3%、2.6%、2.8%、1.7%、2.2%，表明方法重復(fù)性良好。

3 討論

既往研究中，已有學(xué)者分別對3 種雜柑皮揮發(fā)油[2-3]和陳皮揮發(fā)油[4-7]進行比較研究，但尚未對多種雜柑皮（10 種）和陳皮（12 種）揮發(fā)油在同一工藝下進行對比研究。因此，傳統(tǒng)陳皮與雜柑皮揮發(fā)油的化學(xué)差異性未能知曉。本研究首次比較了10 種雜柑皮和12種陳皮揮發(fā)油的化學(xué)成分差異，旨在為雜柑皮的進一步開發(fā)利用提供參考。

陳皮作為常見中藥品種，其質(zhì)量受產(chǎn)地[5-7]、加工炮制方法[8-9]、貯藏時間[10-12]、蟲蛀[13]等多重因素影響。課題組從品種角度出發(fā)，通過氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）聯(lián)用技術(shù)，快速對比分析雜柑皮、陳皮揮發(fā)油的化學(xué)組成和相對含量，為其“正本清源”。在鑒定出的化合物中，10 種雜柑皮和12 種陳皮揮發(fā)油共同含有α-蒎烯、檜烯、月桂烯、檸檬烯、芳樟醇、癸醛、2,2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）等成分，結(jié)合總離子流圖所示，其中檸檬烯含量最高，說明雜柑皮與陳皮揮發(fā)油成分有一定的相似性。但檸檬烯在雜柑皮揮發(fā)油中的平均相對含量為92.87%，而在陳皮中含量較少，僅為84.40%，兩者具有顯著性差異（P＜0.001）。并且雜柑皮與陳皮揮發(fā)油中α-蒎烯（P＜0.01）、檜烯（P＜0.05）和癸醛（P＜0.05）在平均相對含量上也有顯著性差異。另外，12種陳皮揮發(fā)油中還共同含有3-崖柏烯、β-蒎烯、萜品烯、異松油烯、4-萜烯醇等成分，而在雜柑皮中僅部分含有，并非其揮發(fā)油的共有組分。以上結(jié)果表明，雜柑皮與陳皮揮發(fā)油又具備一定的差異性。因此，3-崖柏烯、β-蒎烯、萜品烯、異松油烯、4-萜烯醇等5種共有成分的有無以及檸檬烯、芳樟醇、癸醛、2,2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）等4 種成分相對百分含量的差異，可聯(lián)合作為雜柑皮與陳皮揮發(fā)油的區(qū)分。

研究發(fā)現(xiàn)，由于提取工藝的不同[14]，陳皮揮發(fā)油成分的研究結(jié)果差別也較大。常見的超臨界CO2萃取法得到的揮發(fā)油組分種類大于水蒸氣蒸餾法[15-16]，因提取的方式各有優(yōu)劣，超臨界CO2萃取法不能完全替代水蒸氣蒸餾法。另外，陳皮有“陳化”去燥性入藥、“陳久者良”之說，王堅等[10]研究發(fā)現(xiàn)不同貯藏年限的陳皮，其揮發(fā)性成分各組分質(zhì)量分數(shù)有很大的不同，陳皮在長期貯存期間揮發(fā)油中檸檬烯含量會逐漸減少[3]，甚至產(chǎn)生一些酸、酯類新組分[11]，推測可能是物質(zhì)之間發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化[12]。因此，不同提取方法、貯藏時間對雜柑皮揮發(fā)油的品質(zhì)是否有影響，以及“陳化”后能否作陳皮使用，需要進一步的研究。

揮發(fā)油只是陳皮物質(zhì)基礎(chǔ)的一部分，陳皮的其他成分如黃酮、生物堿和多糖類化合物也多見報道[17-18]。以上10 種雜柑皮的其他非揮發(fā)性成分是否也與陳皮相同，尚不明確，有待進一步研究。

綜上所述，本課題組通過GC-MS 方法，對比了主流雜柑皮和傳統(tǒng)陳皮揮發(fā)油的化學(xué)組成和相對含量的差異，結(jié)果表明，與陳皮相比，雜柑皮揮發(fā)油化學(xué)成分種類少，且二者以檸檬烯為首的共有組分的相對含量有顯著性不同。但雜柑皮是否可以直接替代傳統(tǒng)陳皮使用，亟待更多的理論支持。

0.16 0.15 84.31 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 5.12醇0.88 1.32 79.70 - 11.060.76 2.23 1.63 - 0.22 0.45 86.370.16 0.88 1.54 - 0.13 0.15 0.35 6.44 0.29 1.20 0.25 0.10 0.22 - -1.48 0.39 1.79 - 0.10 0.15 0.15 0.66 0.35 0.13 - - - 0.28 0.72 90.13 - 4.31 0.06 - - - 0.04 - 0.08 - -0.25 0.94 0.50 - - 0.12 1.91 - 0.19 0.12 0.39 0.15 1.84 0.09 1.57 - 0.12 86.81 - 6.62 0.26 0.07 0.81 0.14 0.45 1.55 0.34 0.13 0.12 83.51 - 5.25 0.39 - - - 0.07 0.34 0.28 - - - 0.16 0.09 5.80 0.48 0.35 0.32 1.60 - 0.13 0.14 0.13 0.17 0.77 0.15 0.83 - - 0.04 0.11 - 0.13 0.34 - - - 0.12 0.22 0.09 0.33 82.331.43 83.55 - 4.86 77.650.05 5.97 0.29 0.06 0.13 - 0.09 1.61 0.20 0.39 82.500.09 4.70 0.27 0.22 0.20/%0.15 0.41 0.13 0.43 - - - 0.11 0.14 - -0.18 0.12 0.11 1.07 0.14 - - 0.05 0.22 1.08 0.42 1.66 0.22 0.19 0.15 87.90 - 6.00 0.27 0.20 0.40 - -含0.54 0.07 0.14 1.12 1.12 0.21 2.42 - - 0.08 4.35 0.32 1.86 - - 88.11分0.59 - - 0.12對0.27 0.30 - 0.07 - 0.06 0.10結(jié)百0.23 - 0.05 0.14 0.28 1.71歸0.80 0.16 0.16 - 91.72 - 3.51 0.16 0.27 0.06 - - 0.03 0.56 0.20 - -0.05量- 0.62相0.35 - 1.66 0.31面0.08 0.42 - 0.34 - - 0.07 0.13 0.25 - 0.07 0.26 - 1.70 0.13 - 93.290.05 - - 0.13 0.06- 0.48 0.07 0.11 - 94.340.05 - 0.12 0.38 - 0.05油0.12 - 0.18 - 0.13一- 0.72 0.16 - 1.95 0.41 - 94.79 - 0.11 - 0.32主0.42 - -S6揮發(fā)- 0.54 0.16 - 1.84 0.13 - 95.650.07 - - 0.07 - 0.06 - - - 0.25 0.10- 0.49值0.16 - 92.790.92 - 1.87 S5陳0.09 0.08 - 0.38 - 0.06 0.11 0.06 0.10 0.30 6.23 0.19 - 1.71 - - 94.86 - 0.09 - 0.09 - - - - 0.08 0.19 - -- 0.57 0.06 0.21 S4柑S3 0.51 1.89雜皮1.54 - - 87.240.20 - 0.20 0.12的0.18 0.14 0.44 0.08 0.86 - 0.22 0.20 - 1.56 - - 94.890.07 0.90 0.74 4皮0.31 - 0.29 - - 0.07 0.06 - -1.24 0.31果0.72 0.08 1.75 - - 89.140.95 4.29 0.23 - 0.07 0.05 0.04 0.19 - 0.05積S7- 0.38 3-Thujene S2 0.26 β-Pinene 0.56烯octanal 0.05 0.06 Ocimene名Limonene Linalool成0.14 Myrcene辛醛4-Carene S8 Limonene oxide α-Terpineol Citronellal Decanal烯Terpinolene 4-Terpineol醇α-pinene烯醇醇樟烯g-Terpinene烯α-蒎Sabenene 1-Nonanal柏β-蒎烯烯檬醛油酯檬烯烯桂月正4-蒈勒烯醛芳壬茅油松檸癸0.32 3-崖檜品辛芹α-松酸香4-萜烯異化羅萜41-5氧烯002867-檸香35-3化007785-000124-13-0 029050-物000127-33-7 27-5稱005989-013877-05-2 91-3 000099-000586-0.03 -醛乙合62-9 85-4 000078-分91-3 S1 70-6 000124-006909-30-4 000106-CAS號000562-14-1 19-6 23-0 0.09 74-3表000098-0.09 - -55-5 000112-31-2 000112-003387-和06-4 6.80 7.74 8.46 10.7811.400.06 9.49 4.91 9.04 0.24 11.7012.4112.777.22 001197-0.03 -6.33 13.250.26 13.50000123-0.03 13.7770-8 cis-Carveol 13.690.09 - 0.06 13.92留間/min編號0.18 - 0.08 Octyl acetate 0.18 - -5.09保時0.12 - 0.11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

- - - - - 0.07 - 0.07 - - 0.42 0.26 1.56 -S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22- - - - - - - - - - 0.13 - 0.05 - - 0.38 -0.04- - - - - - - - - - 0.08 - - - - 0.07 0.06 - - - - - - - - 0.07 - - - - - -0.54 0.07 - - - - 0.07 - 0.10 - 0.29 0.09 0.18 - 0.07- - 0.05 - - 0.05 - - - - - - - - - - -0.06 0.07- - - - 0.11 - 0.05 - 0.11 1.70 -0.06 0.15 0.04 - 0.08分- 0.13 - - - - - - 0.09 - 0.61 0.35 - 0.06 0.07對0.08 - - - - - 0.04 0.05 0.50 0.08 0.04 - 0.04 - 0.09 - - - - 0.07 - - - - - 0.09 0.11 - 0.15 0.47 0.07 - 0.06 - - 0.07 - 0.17 - - - 0.06 - 0.07 - - 0.06 0.19 0.03 - 0.05 - - 0.07 - - - - - - 0.05 0.07 - - 0.04 0.08 0.20 - - - 0.07 - - - - 0.08 - 0.03 - - 0.04 -0.07 - 0.06百- - - - - 0.05 - 0.04 - - - - 0.06 - - - 0.05 0.04 - - - 0.23 - - 0.15 -S6 0.13 - - - - 0.08 - - 0.03 - - - 0.06續(xù)S5 0.09 - 0.10 - 0.11 0.04 - 0.04 - - 0.08 - - - - - - - 0.07 - - -0.09 - 0.10 0.05 - - - - - 0.04相表0.06 0.20 - 0.03 - - 0.05 - - 0.09 - 0.13- - - - - 0.05 - - - - - - 0.19 - - 0.12 -0.14 0.04 - - -S3 0.04 - 0.16 S2 0.07 - - - - 0.05 - - - - 0.06 S8 S4 0.19 - 0.06 - 0.06 -0.09 S7含0.08 0.19 0.05 - - - - - - - - - - - - - - - 0.06 D(+)-Carvone醚芹烯-2-基）-3-二基trans-2-Decenal cis-Anethol己物/%nerol acetate Citral 酚（香苯醛Elemene Elemene檬茴基-1-甲醇醛）Dodecyl aldehyde基甲基烯苯香-2-甲香基量-5-甲腦-3-甲花醛Undecanal(1-methylethyl)-Benzene烯0.10 - 0.12-1-（丙烯)-1-環(huán)一二基（丙4-ethenyl-4-methyl-1-(propan-2-2-methoxy-4-methyl-1-醛酮檸0.26 1,2,6,6-四香基酯茅香酚）4-異丙S1丙基-4-甲-1-烯橙α-蒎酚-2-基）烯欖欖茴基α-pinene基基十香2-異酸1-carboxaldehyd乙右烯乙醛5-Isopropyl-2-methylpheno名基式Citronellol 4-(1-methylethenyl)-1-Cyclohexene-芹醛（十桂丙5-異1,2,6,6-Tetramethyl Diallyl反月-2-癸3-methyl-4-isopropylphenol烯22-9稱旋005392-40-5 002111-丙4-乙16-8 75-3香003913-81-3 002244-000104-46-1 000499-75-2 000112-003228-000106-02-2 020307-84-0 000112-002792-39-4 000141-12-8 003856-0.06合25-5 yl)-3-(prop-1-en-2-yl)000515-13-9 56-8 000515-4-(1-甲13-9 54-9 44-7 CAS號14.1014.6715.1114.4614.2214.5914.9415.24保時15.7815.9714.8416.440.06 001076-留間/min 15.590.11 0.09烯16.2916.5716.791.85 -0.29化1.23編號1.16 0.10 0.06 14.0321 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37

- 0.17 0.31 0.10- --- - - - 0.09 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 0.21 - 0.11 0.08 ---- - - 0.19 - - --- 0.08 - - 0.07 0.14-0.22 0.10 0.66- - 0.06-0.07- - 0.04--- - - 0.64 - - --- - - - 0.08- 0.20 0.30- - 0.06--- - - - - - --- - - - 0.15 0.23-0.23 0.42 - -0.14- - - - 0.11 0.66 0.09 - 1.23 0.32- 0.21 0.19-0.26- 0.19 0.07 -0.20- - - - 0.05 0.93 0.10 0.52 0.14-0.26- 0.10 - 1.12 0.60含- 0.27 0.10 - --- 0.05 - - 0.17 0.36-0.28- - 0.08--- - - - - - --- 0.11 - - 0.15/%1.22 0.63- - 0.10--0.05 - - - - - --- - - - 0.06- - ---0.03 - - 0.09- - ---- - - 0.14- - ---- - 0.05分百相0.07 - --- - - - 0.07 0.21 0.06 - --- 0.30 - - 0.13 0.34對0.05 --0.09 - 0.06 - 0.13- - ---- - - 0.06 0.34 0.45 - 0.15- 0.06 -0.06-- - 0.93 - 0.17 0.04 - --- - - - 0.17 S7表續(xù)0.07 - --0.07 S6 0.25 - 0.06- - ---- - - 0.07 0.08 0.06 0.12 - 0.10-0.10- 0.05 -0.02-0.08 - 0.66 0.15 2,2′-Methylenebis(6-tert-butyl-4-S8 1.23 0.12量- 0.07 ---- - 0.88 - 0.14 - 0.10-0.05 - 0.06 0.06 0.10 0.07 - - 0.15酯甲S5酯S4 0.07 - ---0.17 - 0.59 a-Sinensal 0.08 - ---0.07 - 0.09 - 0.06 - 0.28-- - 0.08 - 0.18 S3 0.12 - - --0.11 1.02定定-1-l-Caryophyllene- - -0.10-- - 0.09，α，α-二出名Magnolol S1 Naphthalene烯cis-b-Copaene出0.07 -0.11- - - - 0.09稱d-Cadinene b-Selinene g-Elemene醇鑒b-Sinensal Methyl 2-(methylamino）benzoate酮（圓基o-Menth-8-ene-4-methanol,a,a-di-未烯甲橘烯0.93松酸苯Diethyl phthalate酸烯烯鑒二未香甲二出0.36-- - 0.31未)苯酚鑒尼橙橙-4-甲巴酮） Nootkanone物氨烯樸甲化合S2竹特亞乙子西厚methylphenol)b-甜α-Farnesene b-古倫-8-烯a-甜2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)g-欖-，（1S，2S，4R）-（-）-（8CI）努d-杜基烯2-(甲b-芹基。出000502-α-法o-癸乙018252-測029873-44-5 000483-99-2--004630-巴methyl-1-vinyl-,(1S,2S,4R)-(-)-(8CI)76-1 017066-000639-99-6 000087-000084-66-2-61-4 67-0 88-8鄰060066-07-3 017909-44-3 004674-50-4 000528-43-8 000119-47-1檢未示000085-16.8917.1717.8618.51定CAS號77-2 18.7719.6621.0718.3918.6222.0922.9120.471-石保時19.15卡23.84柚0.08 -0.14- - - - 0.19 0.05 -0.34- 0.05 - - 0.33 30.270.06留間/min 0.09 17.7631.1491-6 17.38：“-”表0.04 0.23 0.11 0.21注編號38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

圖1 揮發(fā)油總離子流圖

表5 雜柑皮與陳皮揮發(fā)油各自共有成分的平均相對含量（平均值± S.E.M）