當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠NO、vWF、EMPs表達(dá)水平影響＊

毛玉娟，何亞麗，江 華，謝 青，王 莉，楊 銳，申進(jìn)增，伊 琳

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 蘭州 30000）

高血壓是我國(guó)逐年遞增的慢性疾病之一，隨著人口老齡化增加，高血壓患病率在逐年提高。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不均衡發(fā)展，人們對(duì)高血壓病認(rèn)識(shí)逐漸提高，但是高血壓控制率仍然較低，因此積極有效控制血壓，才能夠有效預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生，提高人們的生活質(zhì)量，是目前刻不容緩的重要公共衛(wèi)生問題。而中藥在治療高血壓方面效果顯著，我國(guó)中藥材種類多、品種齊全、質(zhì)量好，研究中藥的降壓機(jī)理顯得尤為重要。因?yàn)槲覈?guó)人口主要以農(nóng)村居多，長(zhǎng)期西藥降壓治療，會(huì)造成家庭以及社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，以及西藥帶來的副作用，所以我們應(yīng)該發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)。隨著人們對(duì)中醫(yī)藥認(rèn)識(shí)的不斷提高，以及我國(guó)大力扶持中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展，中藥被越來越多的病人所接受。目前，高血壓的有關(guān)治療主要以西藥為主中藥為輔，從而能夠更好的控制血壓，這樣既能夠緩解西藥的副作用，同時(shí)可以改善患者的癥狀。趙君等［1］運(yùn)用中藥治療原發(fā)性高血壓患者，通過隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的Meta 分析發(fā)現(xiàn)，中藥聯(lián)合西藥組能提高降壓療效、中醫(yī)證候療效，說明中藥治療原發(fā)性高血壓有一定的優(yōu)勢(shì)，能夠起到補(bǔ)充治療的作用。

當(dāng)歸是祖國(guó)醫(yī)學(xué)的傳統(tǒng)中藥，始載于《神龍本草經(jīng)》，是歷代醫(yī)家常用之藥。當(dāng)歸也是甘肅的道地藥材，以岷縣產(chǎn)量多、質(zhì)量好，是傘形科當(dāng)歸屬的一種多年生草本植物［2］。當(dāng)歸的藥理作用非常廣泛，具有增強(qiáng)免疫力、抑制血小板聚集、抗溶血、抑制心率、改善心肌缺血、保護(hù)肝臟、改善缺氧等作用［3］，及當(dāng)歸的一般化學(xué)成分對(duì)心血管有積極調(diào)控作用。當(dāng)歸藥性，屬甘、辛，溫。歸肝、心、脾經(jīng)。功效為補(bǔ)血調(diào)經(jīng)，活血止痛，潤(rùn)腸通便。其中有機(jī)酸類、當(dāng)歸揮發(fā)油等是當(dāng)歸的化學(xué)成分，也是有效成分之一。當(dāng)歸揮發(fā)油主要分類為3 種油性物質(zhì)，分別為酚性油、中性油和酸性油，油性比例最高為中性油，占當(dāng)歸揮發(fā)油的總比例88%以上，其中藁本內(nèi)酯、當(dāng)歸酮、丁烯基酞內(nèi)酯、亞丁基苯酞、洋川芎內(nèi)酯等為其主要化學(xué)成分［4］。有研究證實(shí)，當(dāng)歸揮發(fā)油可以降壓，主要降壓作用當(dāng)歸揮發(fā)油各組分（5-羥甲基糠醛、鞣酸、腺苷和牛磺酸）共同作用的結(jié)果，降壓機(jī)制通過多種因素綜合作用結(jié)果，其中包括Ca2+通道被抑制、中樞M、β 受體和外周M 膽堿受體被激活、血管擴(kuò)張、血流加速、血液黏稠度以及腎素-血管緊張素活性降低［5］。劉倍吟等［6］通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸揮發(fā)油能夠降低SHR 的血壓，降低SHR血清中內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1)、C反應(yīng)蛋白（Creactive protein，CRP）、血管細(xì)胞黏附分子-1（Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)當(dāng)歸揮發(fā)油的降壓機(jī)制可能與血管的炎性反應(yīng)有關(guān)。

本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)歸揮發(fā)油具有降壓作用，對(duì)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮、心肌組織具有保護(hù)作用，其降壓作用可能與抑制血清中內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1)、血 管 內(nèi) 皮 生 長(zhǎng) 因 子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、前列環(huán)素I2（Prostaglandin I2，PGI2）、腎素和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（AngiotensinⅡ，Ang Ⅱ）水平有關(guān)，其降壓機(jī)制可能與保護(hù)血管內(nèi)皮、改善動(dòng)脈血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)、影響血清中血管活性物質(zhì)水平有關(guān)。為進(jìn)一步探討其可能的降壓機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓大鼠作為研究對(duì)象，觀察當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)其血壓及血管假血友病因子（vWF）、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒（EMPs）水平等血管活性物質(zhì)的影響，來探討其可能的降壓機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇與分組

6 只8 周齡雄性Wistar 大鼠(體重180-220 g)為正常組,購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，無特定病原體動(dòng)物（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK(甘)2015-0002]。30只同周齡同體重（180-220 g）雄性SHR，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SPF級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK(京)2016-0006]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

當(dāng)歸揮發(fā)油購(gòu)西安四季生物科技有限公司（批號(hào)：SJDY180207），纈沙坦（北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20040217），NO、vWF 的ELISA 試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：180614050R）,EMPs的ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1812R），多功能酶標(biāo)儀（Tecan Infinite,瑞士），MS60無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定分析系統(tǒng)（MS60，上海玉研科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組及給藥

將30 只SHR 隨機(jī)分為模型組、纈沙坦組及當(dāng)歸低、中、高劑量組，取同周齡Wistar 大鼠作為正常組（6只）。其中，纈沙坦組為8 mg·（kg·d）-1，當(dāng)歸揮發(fā)油低、中、高劑量組分別予以當(dāng)歸揮發(fā)油0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL，相 當(dāng) 于 含1%、3%、9% 當(dāng) 歸 揮 發(fā) 油 乳 劑2.0 mL·（kg·d）-1。其中正常組和模型組大鼠給予等量蒸餾水，給藥方式為灌胃，1 次/d,7 天/w,給藥4 周。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度（23.0± 2.0）℃，相對(duì)濕度（35± 5）%，換氣量10～20 次/h，日光燈采光，明暗交替，常規(guī)充足飼料喂養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境安靜。

1.3.2 血壓檢測(cè)

在大鼠清醒狀態(tài)下采用套尾法測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓，測(cè)量前用恒溫水（40℃）使大鼠尾部松軟，皮溫升高，從而擴(kuò)張大鼠尾動(dòng)脈，于大鼠尾部尾動(dòng)脈部位安裝尾套。使得血壓測(cè)定系統(tǒng)的脈搏傳感器與大鼠尾動(dòng)脈精密接觸，在大鼠安靜狀態(tài)下，待血壓界面出現(xiàn)穩(wěn)定的脈搏開始測(cè)量血壓。正式實(shí)驗(yàn)前測(cè)量血壓1次，待實(shí)驗(yàn)開始后每周測(cè)量血壓1次，連續(xù)測(cè)量4周。

1.3.3 標(biāo)本的采集

連續(xù)給藥4 周后，給予大鼠10% 水合氯醛（0.03 mL·kg-1）麻醉大鼠，于腹主動(dòng)脈取血8 mL，精置30 min，以4℃，3 × 103 r·min-1離心10 min，分離出血清，置放于-20℃冰箱備用。

1.3.4 ELISA檢測(cè)血清中vWF、EMPs、NO水平

本研究嚴(yán)格采用大鼠vWF、EMPs、NO 的ELISA 試劑盒說明書操作。分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，其中每組均設(shè)置1個(gè)復(fù)孔，然后分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，以及加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、重復(fù)溫育、重復(fù)洗滌、顯色、終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度，加終止液后15 min 內(nèi)測(cè)定開始進(jìn)行。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組血清中vWF、EMPs、NO的相應(yīng)濃度。

表1 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)SHR大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的影響(±s,n = 6)

表1 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)SHR大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的影響(±s,n = 6)

注：△1 mmHg ＝0.133 kPa。①與正常組比較，P＜0.01；②治療1、2、3 周纈沙坦組、當(dāng)歸低、中、高劑量組與正常組比較，P＜0.01；治療4 周纈沙坦組與正常組比較，P＞0.05；治療4周當(dāng)歸低劑量組與正常組比較，P＜0.01；治療4周當(dāng)歸中、高劑量組與正常組比較，P＜0.05；治療4周纈沙坦組、當(dāng)歸低、中、高劑量組與模型組比較，P＜0.01

治療4周/mmHg 144.17±7.73196.17±8.841）148.33±7.312）158.00±5.592）153.67±5.242）153.00±5.482）組別正常組模型組纈沙坦組當(dāng)歸低劑量組當(dāng)歸中劑量組當(dāng)歸高劑量組治療前/mmHg△135.83±17.35189.00±7.871）184.17±2.64185.33±3.33185.00±2.61186.33±6.31治療1周/mmHg 141.33±4.41189.67±6.711）180.83±5.462）183.17±6.742）181.17±4.542）181.50±3.402）治療2周/mmHg 143.17±5.78194.00±5.831）170.83.±5.812）174.67±4.842）172.00±5.372）171.17±4.262）治療3周/mmHg 144.17±5.71198.50±8.171）154.83±6.112）163.67±6.532）163.17±4.622）159.83±5.152）

表2 各組自發(fā)性高血壓大鼠血清EMPs、vWF、NO含量的比較(±s,n = 6)

表2 各組自發(fā)性高血壓大鼠血清EMPs、vWF、NO含量的比較(±s,n = 6)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

NO/(μmol·L-1)24.08±0.428.63±0.24**21.15±0.16△△19.92±0.17△△18.70±0.23△△21.28±4.70△△組別正常組模型組纈沙坦組當(dāng)歸低劑量組當(dāng)歸中劑量組當(dāng)歸高劑量組只數(shù)66 6 6 6 6 EMPs/(pg·L-1)129.93±2.23263.62±13.14**157.24±15.89△△173.31±04.31△△175.72±2.27△△194.06±03.49△△vWF/(ng·L-1)412.90±3.65634.53±1.26**456.72±3.65△△492.12±3.86△△509.39±2.19△△528.35±5.50△△

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用spss 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間采用重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析；2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05、P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)SHR血壓的影響

治療前纈沙坦組、當(dāng)歸低、中、高劑量組和正常組比較血壓明顯偏高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

治療1 周纈沙坦組、當(dāng)歸低、中、高劑量組和正常組比較，均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療2 周纈沙坦組、當(dāng)歸低、中、高劑量組和正常組比較，均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療3 周纈沙坦組、當(dāng)歸低、中、高劑量組和正常組比較，均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療4 周纈沙坦組和正常組比較無顯著差異（P＞0.05），當(dāng)歸低劑量組和正常組比較均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），當(dāng)歸中、高劑量組和正常組比較有顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

治療4周，纈沙坦組、當(dāng)歸低、中、高劑量組和模型組比較，均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

2.2 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)SHR血清中NO、EMPs、vWF的影響

與正常組比較，模型組血清中EMPs 和vWF 含量顯著升高（P＜0.01），NO 含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較各給藥組可不同程度地降低血清中EMPs、vWF 水平（P＜0.01）；與模型組比較各給藥組NO含量升高（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

3 討論

高血壓是最常見的慢性疾病之一，2018年8月，歐洲高血壓學(xué)會(huì)和歐洲心臟病學(xué)會(huì)聯(lián)合宣布2018年高血壓管理指南，指出在全球范圍內(nèi)患有高血壓的人數(shù)已經(jīng)超過10億，這是一個(gè)龐大的患者群體。隨著人們生活壓力的增加、各種不良的生活方式（高鹽飲食、久坐不動(dòng)、嗜酒、吸煙）以及全球人口的老齡化，預(yù)計(jì)在2025年全球高血壓患病人數(shù)將達(dá)到15 億［7］。高血壓是中風(fēng)和心血管等疾病的主要危險(xiǎn)因素，是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因，因此有效降低血壓，以預(yù)防中風(fēng)及心血管疾病等并發(fā)癥的發(fā)生，降低患者死亡率［8］。在研究高血壓發(fā)病機(jī)制時(shí)，人們將從血管活性物質(zhì)以及結(jié)構(gòu)和功能的改變?nèi)齻€(gè)方面著手。血管活性物質(zhì)又稱為血管舒縮劑，是由機(jī)體臟器、組織產(chǎn)生的一些對(duì)血管具有舒張或者收縮作用的生物介質(zhì)。這些生物介質(zhì)對(duì)許多臟器系統(tǒng)有顯著作用，但最明顯是對(duì)循環(huán)系統(tǒng)作用，直接作用于血管平滑肌，使血管產(chǎn)生收縮和舒張作用［9］。高血壓的發(fā)生主要是因?yàn)閯?dòng)脈血管的變化導(dǎo)致的。血壓升高導(dǎo)致血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能受損，進(jìn)一步使得血液中血管活性物質(zhì)失去動(dòng)態(tài)平衡，從而加重高血壓［10］。

EMPs 是激活或凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的有生物學(xué)活性的微粒，對(duì)于其檢測(cè)能直接反映血管內(nèi)皮的損傷狀態(tài)。EMPs 是1999年被法國(guó)學(xué)者Combes 等［11］在研究體外產(chǎn)生內(nèi)皮微粒和狼瘡抗凝劑患者可能的促血栓形成活性的實(shí)驗(yàn)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的，微粒的體積一般在0.1-1 μm 大小。EMPs 攜帶源自母細(xì)胞表面的不同抗原微粒具有不同的特性，其中可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抗原微粒有CD144、CD51/61、CD105、CD31，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)的抗原微粒有CD62E、CD54、CD106［12］。在多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，EMPs 在血管的炎性反應(yīng)、血栓的形成、血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及修復(fù)、血管內(nèi)皮的粥樣硬化、缺血性腦卒中等多種血管疾病的發(fā)生發(fā)展的過程中起到非常重要的作用［13-14］。Jain 等［15］發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)重高血壓患者血漿中EMPs 水平顯著增高，并在高血壓引起的靶器官損傷中起重要作用，認(rèn)為血漿EMPs 是內(nèi)皮損傷最直接的產(chǎn)物。EMPs 可抑制一氧化氮合酶磷酸化，使NO 的生成減少。EMPs 可激活p38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK）通路，刺激腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-6（Interleukin-6，IL-6）的增加，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)造成血管內(nèi)皮損傷［16］。研究表明，EMPs 促使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎性因子、損害內(nèi)皮功能障礙均通過轉(zhuǎn)錄因子核因子-kB（Nuclear-factor κappa B，NF-kB）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通絡(luò)進(jìn)行，從而破壞血管舒張功能，進(jìn)一步抑制NO合成［17］。

NO 作為舒血管物質(zhì)，在調(diào)節(jié)血壓方面起著重要作用，NO 實(shí)現(xiàn)生物學(xué)作用主要是通過啟動(dòng)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，進(jìn)一步生成環(huán)鳥苷酸，使得增加環(huán)鳥氨酸在細(xì)胞內(nèi)水平［18］。NO 能夠調(diào)節(jié)血壓是因?yàn)閿U(kuò)張了血管平滑肌，持續(xù)性NO 是生成減少或者功能異常，均會(huì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而降低NO 的生物活性［19］。使得血壓升高，最終損害血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制NO 的合成，使血壓狀態(tài)持續(xù)處于高水平［20］。孫彩紅等［21］研究發(fā)現(xiàn)在高血壓患者中，血清NO 與收縮壓升高，可能與交感神經(jīng)的激活以及副交感神經(jīng)抑制有關(guān)。內(nèi)皮功能的紊亂源于自主神經(jīng)功能紊亂造成的，也是其致病因素，同時(shí)有可能存在第3 因素。吳國(guó)泰等［22］通過高血壓大鼠模型研究當(dāng)歸揮發(fā)油的降壓機(jī)制，采用L-硝基-精氨酸（N-nitro-L-arginine，L-NNA）誘導(dǎo)小鼠制造高血壓模型，其中L-NNA為非選擇性一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）抑制劑，使小鼠體內(nèi)NO 合成不足，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油中、高劑量能夠降低SHR的收縮壓（Systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（Diastolic blood pressure，DBP）、平均血壓（Mean blood pressure，MBP）水平，通過實(shí)驗(yàn)推測(cè)當(dāng)歸揮發(fā)油可能與拮抗L-NNA 有關(guān)，促使體內(nèi)NO 的合成，從而進(jìn)一步降低血壓，可能的降壓機(jī)制與受體操作性Ca2+通道（Receptor-operated Ca2+channel，ROCC）和電壓操作性Ca2+通道（Voltage-operable Ca2+channel，VOCC）介導(dǎo)的主動(dòng)脈平滑肌收縮均有抑制作用有關(guān)，從而呈現(xiàn)非特異性鈣通道阻滯作用。

vWF是一種糖蛋白，這種糖蛋白是由第12號(hào)染色體所編碼，vWF 可以結(jié)合膠原纖維以及血小板，使得血管破裂大量血小板可以貼附在膠原纖維而形成血栓，最終才能夠止血。vWF 在正常生理情況下大部分是由內(nèi)皮細(xì)胞合成，小部分是由巨噬細(xì)胞合成，合成后分別儲(chǔ)存于棒桿狀小體（Weibel-palade body，W-P小體）內(nèi)和血小板顆粒中，其中W-P 小體與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切［23］。vWF 是一種特異性標(biāo)志物，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，vWF 迅速釋放入血使血小板凝聚，進(jìn)一步形成血栓［24］。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中，以高血壓頸動(dòng)脈硬化患者實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)組血清vWF 水平明顯高于對(duì)照組，并且血清中vWF 水平與頸動(dòng)脈的硬化程度呈正相關(guān)［25］。

本研究結(jié)果顯示，纈沙坦、當(dāng)歸低、中、高劑量組均能夠有效降低SHR 的血壓，并能降低血清vWF、EMPs 的表達(dá)，升高NO 的表達(dá)，說明其降壓作用與血清中vWF、EMPs 水平有關(guān)。根據(jù)表1，可以看出，治療前后血壓比較，治療1、2、3 周后各治療組的血壓下降程度明顯，尤以纈沙坦組血壓下降程度突出，治療4周后纈沙坦組血壓下降程度減弱，當(dāng)歸低、中、高劑量組降壓趨于穩(wěn)定。因此，可以推測(cè)出，纈沙坦組的降壓速率快，但是治療效果不穩(wěn)定。當(dāng)歸低、中、高劑量組降壓速率慢，但是治療效果恒定。因此，中藥的降壓效果仍然存在一定的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，本研究推測(cè)當(dāng)歸降低血清vWF 的水平，可以降低血小板的粘附聚集，從而抑制血栓的形成，防止動(dòng)脈硬化的發(fā)生，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)的作用。通過降低EMPs 的水平，防止炎癥損傷，從而更進(jìn)一步提高NO的水平，舒張血管，維持血壓穩(wěn)定。