恩施巴戟環(huán)烯醚萜苷類成分提取工藝優(yōu)選及抗氧化活性研究

段金輝，劉 陽，黃容吉，胡 楊，阮金蘭 （. 武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430223；2. 武漢工程

大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205）

恩施巴戟，也叫湖北巴戟、鄂西巴戟，系茜草科虎刺屬植物四川虎刺（Damnacanthus officinarumHuang）的干燥根，它與茜草科巴戟天屬的南藥巴戟天（Morinda officinalisHow）在成分和功效上有諸多相似之處[1-4]，在湖北恩施地區(qū)常被作為巴戟天的替代品用于臨床[5]，并作為土家族藥材被收載進(jìn)《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2009 年版）[6]。由于產(chǎn)地偏僻、資源貧乏等原因[7]，使得恩施巴戟的藥用價(jià)值沒有得到應(yīng)有的重視和合理的開發(fā)，應(yīng)用范圍十分有限，相關(guān)研究所見甚少。為了更好地開發(fā)和利用恩施巴戟的藥用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)研究了恩施巴戟環(huán)烯醚萜苷類成分的最佳提取條件，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行初步探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A 高效液相色譜儀；UV-1800 紫外-可見分光光度計(jì)；BS 224 S 型萬分之一天平；CPA225D型十萬分之一天平；HH-S 型水浴鍋。

1.2 材料

恩施巴戟采于湖北省恩施市，經(jīng)本課題組阮金蘭教授鑒定為茜草科虎刺屬植物四川虎刺（Damnacanthus officinarusHuang）的根；水晶蘭苷對(duì)照品（批號(hào)：111870-201303）購自中國食品藥品檢定研究院；DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼，批號(hào)：W30O8E46572）購自源葉生物；甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 水晶蘭苷的含量測(cè)定[8-10]

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色 譜 柱：Ultimate LP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸水溶液（5:95）；檢測(cè)波長：231 nm；流速1 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μl。在上述條件下, 供試品溶液中水晶蘭苷色譜峰與其他峰分離良好, 分離度大于1.5, 峰形對(duì)稱,保留時(shí)間約為8.5 min。理論板數(shù)按水晶蘭苷峰計(jì)不低于3 000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取水晶蘭苷對(duì)照品9.40 mg，加水定容至10 ml，配制成0.940 mg/ml 的水晶蘭苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取恩施巴戟藥材粗粉10.0 g，精密稱定，用6 倍量60%的乙醇浸泡過夜后，80 ℃加熱回流提取1 h，放冷過濾，濾液減壓濃縮后60 ℃真空干燥至恒重。浸膏以水定容至50 ml，從中取出1 ml 以水稀釋至25 ml，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)中對(duì)照品儲(chǔ)備液100、200、300、400、500 μl 分別加水稀釋至1 ml，配成系列對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μl，記錄對(duì)照品的峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，水晶蘭苷的質(zhì)量濃度（X，mg/ml）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得回歸方程為Y=5×106X+11 555，r=1.000 0，水晶蘭苷在0.089 6～0.447 9 mg/ml 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定水晶蘭苷峰面積，計(jì)算得峰面積RSD 為0.65%，表明儀器的精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一恩施巴戟藥材粗粉6 份，按“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)得水晶蘭苷峰面積，RSD 為1.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫放置，分別在 0、2、4、8、12、24 h 后測(cè)定峰面積,RSD 為0.33%，結(jié)果表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量的供試品溶液6 份，分別與已知濃度的水晶蘭苷對(duì)照品溶液等體積混合，測(cè)定混合后水晶蘭苷的峰面積并計(jì)算平均回收率為100.29%，RSD 為0.66%。

2.2 提取工藝優(yōu)化[11-12]

本試驗(yàn)采用常用的加熱回流提取法，結(jié)合L9(33)正交試驗(yàn)表，優(yōu)選提取工藝。選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、溶劑倍量(B)、提取時(shí)間(C)為考察因素，每個(gè)因素選取 3 個(gè)水平，以浸膏得率、水晶蘭苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別為0.3、0.7,綜合評(píng)分=浸膏得率/浸膏得率最大值×30% +水晶蘭苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)/水晶蘭苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大值×70%。藥材取樣量及提取液的處理同“2.1.3”項(xiàng)。具體試驗(yàn)方案見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由直觀分析可知，各因素對(duì)恩施巴戟環(huán)烯醚萜苷類成分提取效果的影響大小排序?yàn)锳＞C＞B。方差分析中發(fā)現(xiàn)極差最小的B 因素的離均差平方和小于誤差效應(yīng)，故將其合并到誤差效應(yīng)中，用合并后的誤差效應(yīng)做F檢驗(yàn)，自由度變大，靈敏度更高。分析結(jié)果顯示，A 因素的影響具有顯著性差異，因素B 和C 則無顯著性影響，結(jié)合生產(chǎn)成本等，確定最佳提取工藝為A1B1C2,即6 倍量的60%乙醇回流提取2 h。

表3 方差分析結(jié)果

稱取3 份恩施巴戟藥材粗粉，按所得最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果浸膏得率平均值為6.93%，RSD 為1.31%，水晶蘭苷得率平均值為1.872%，RSD 為1.06%。說明該工藝穩(wěn)定可行，具有較好的提取效果。

2.3 體外抗氧化活性研究

2.3.1 不同極性樣品溶液的制備

恩施巴戟提取液減壓濃縮后，與硅藻土均勻拌樣，分別用乙酸乙酯、正丁醇、甲醇進(jìn)行固液萃取得到3 個(gè)不同極性部位，減壓濃縮后得到乙酸乙酯部位（F1）、正丁醇部位（F2）、甲醇部位（F3）以及總膏（E）共4 個(gè)樣品。稱取適量樣品溶于70%的乙醇得到一定濃度的樣品溶液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。抗氧化試驗(yàn)均以抗壞血酸Vc 作為陽性對(duì)照。

2.3.2 總還原能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]方法，于700 nm 處測(cè)定吸光度值，吸光度越高，說明還原能力越強(qiáng)，結(jié)果如圖1。由圖1 可知，恩施巴戟不同極性的提取物均有不同程度的還原能力，且呈明顯的量效關(guān)系。以吸光度為0.5 時(shí)的樣品濃度為EC50，E、F1、F2、F3 的EC50分別為3.299、2.003、3.493、4.205 mg/ml，抗壞血酸的EC50為0.06792 mg/ml，即各極性提取物的還原能力大小順序?yàn)镕1＞E≈F2＞F3，結(jié)果表明乙酸乙酯部位的還原能力最強(qiáng)。

2.3.3 DPPH 自由基清除率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13-14]方法，測(cè)定恩施巴戟對(duì)DPPH 自由基的清除能力，結(jié)果如圖2。由圖2 可知恩施巴戟不同極性的提取物都對(duì)DPPH 自由基有一定的清除能力，且呈一定的量效關(guān)系。以清除率為50%的樣品濃度為EC50，E，F(xiàn)1、F2、F3 的EC50分別為2.045、0.648 5、1.971、2.812 mg/ml，抗壞血酸的EC50為0.019 79 mg/ml，可見恩施巴戟不同極性提取物對(duì)DPPH 清除能力的大小順序?yàn)镕1＞F2≈E＞F3，即乙酸乙酯部位對(duì)DPPH 有最佳清除效果。

2.3.4 羥自由基清除率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15-16]方法，并做適當(dāng)改進(jìn)。取1 ml不同濃度樣品溶液于試管中，分別加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.4）、1.5 mmol/L 鄰菲羅啉、1.5 mmol/L 硫酸亞鐵溶液各1 ml，最后加入10 mmol/L的過氧化氫溶液1 ml，37 ℃水浴保溫1 h，于510 nm處測(cè)定吸光度為Ax，樣品以溶劑代替測(cè)得吸光度為A損傷，樣品和過氧化氫均以對(duì)應(yīng)溶劑代替測(cè)得吸光度為A未損傷。清除率=（Ax-A損傷）/(A未損傷-A損傷），結(jié)果如圖3。由圖3 可知，在所選濃度范圍（0.25～1.25 mg/ml）內(nèi)，恩施巴戟提取物中只有F1 表現(xiàn)出對(duì)羥自由基的清除能力，其EC50為1.576 mg/ml，陽性對(duì)照抗壞血酸的EC50為0.576 7 mg/ml，可見恩施巴戟提取物中僅乙酸乙酯部位對(duì)羥自由基有較好的清除效果。

3 討論

環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)為恩施巴戟的主要活性成分之一，本研究以水晶蘭苷為指標(biāo)性成分結(jié)合浸膏得率，采用綜合評(píng)分，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)加熱回流過程中的幾個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行了考察，確定了恩施巴戟環(huán)烯醚萜苷類成分的最佳提取工藝，同時(shí)建立了恩施巴戟中水晶蘭苷含量測(cè)定的方法，為相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了基礎(chǔ)。

體外抗氧化試驗(yàn)對(duì)恩施巴戟不同極性部位的總還原能力、清除DPPH 自由基和清除羥自由基的能力分別進(jìn)行了考察，得出了較一致的結(jié)果，即恩施巴戟具有一定的抗氧化活性，且主要活性部位在乙酸乙酯部位，為恩施巴戟的活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究和資源開發(fā)利用提供了參考。