硫化銅納米粒的處方工藝優(yōu)化與體外評價

陳珍珍，陶 春，張雪婷，周桂芝,3，張 倩，宋洪濤 （. 福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院/第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 35000；. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 35008；3. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 35008）

光熱療法（photothermal therapy，PTT）是近年來新興的腫瘤治療技術(shù)，相比傳統(tǒng)的手術(shù)治療、化療和放療，具有更小的副作用[1-4]。PTT 包含2 個要素，即近紅外光和光敏劑。近紅外光具有較強的組織穿透能力[5-6]，照射后腫瘤組織中的光敏劑可將光能轉(zhuǎn)換為熱能，當(dāng)溫度達(dá)到42 ℃以上時，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡或壞死[7]。

硫化銅（CuS）納米粒是一種優(yōu)良的光敏劑。相比廣泛研究的金納米粒，CuS 納米粒具有制備成本低的優(yōu)點，特別是其具有穩(wěn)定的光熱效應(yīng)。CuS 納米粒的近紅外吸收主要源于Cu2+的d-d 能級躍遷，因而其光熱效應(yīng)不受粒徑、形狀和生理環(huán)境的影響，可在腫瘤組織中維持穩(wěn)定的光熱效應(yīng)[8]。CuS納米粒具有良好的生物相容性，細(xì)胞毒性較低，但與其他多數(shù)無機或金屬納米粒同樣存在體內(nèi)發(fā)生蓄積的風(fēng)險，長期使用的安全性未知。腎臟是處理納米粒的主要器官之一，報道顯示，直徑小于6 nm的納米?？杀荒I臟濾過，從而使大部分納米粒經(jīng)尿液排出體外[9-10]。

因此，本文擬制備粒徑小于6 nm 的CuS 納米粒，通過深入分析各因素，獲得最優(yōu)的處方工藝，進(jìn)一步通過光熱曲線和細(xì)胞實驗進(jìn)行體外評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Litesizer500 納米粒度及Zeta 電位分析儀（奧地利Anton Paar 公司）；JEOL 2010 透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；MDL-H-980-5W 上轉(zhuǎn)換發(fā)光用激光器（長春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司）；RX-300 紅外熱成像儀（廣東省東莞市不凡電子有限公司）；NVMT SPARTAN 夜視儀（梅越電子商務(wù)有限公司）；DV215CD 精密分析天平（美國Ohaus Discovery 公司）；HWS 26 電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；H1850R 臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；明澈-D24UV 純水/超純水一體化系統(tǒng)（德國Merck Millipore 公司）

1.2 材料

二水合氯化銅（CuCl2·2H2O）、九水合硫化鈉（Na2S·9H2O）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；聚維酮（polyvinylpyrrolidone，PVP，MW=10 000，默克生命科學(xué)有限公司）；細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒（CCK-8，北京索萊寶生物技術(shù)有限公司）；RPMI1640 培養(yǎng)液，DMEM 不完全高糖培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）；透析袋（MWCO 14000，美國Viskase 公司）；去離子水（實驗室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 硫化銅納米粒的制備

參考文獻(xiàn)確定CuS 納米?；咎幏絒11]：取100 μl CuCl2溶液（300 mmol/L）加入10 ml PVP 溶液（100 mg/ml）中，再加入30 μl Na2S 溶液（1 mol/L），室溫磁力攪拌5 min 后，轉(zhuǎn)入90 ℃水浴繼續(xù)磁力攪拌15 min，測定其粒徑和多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）。

2.2 單因素考察

考察攪拌時間、水浴溫度、水浴時間、PVP 濃度、CuCl2與Na2S 摩爾比（Cu:S）對CuS 納米粒粒徑和PDI 的影響。

表1 結(jié)果顯示，攪拌時間越長，水浴溫度越低，Cu:S 越小，則CuS 納米粒粒徑呈減小趨勢。水浴時間越長，PVP 濃度越大，粒徑顯示了先增大后減小的趨勢。綜合各因素不同水平對應(yīng)的納米粒粒徑，發(fā)現(xiàn)水浴溫度、PVP 濃度和Cu:S 易產(chǎn)生較大的粒徑波動，表明其可能是影響CuS 納米粒粒徑的主要因素。另外，各因素不同水平對PDI 的影響均不顯著。因此，根據(jù)單因素考察結(jié)果，確定攪拌時間為5 min，水浴時間為15 min，以粒徑為評價指標(biāo)，采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化水浴溫度、PVP 濃度、Cu:S 三個因素。

表1 CuS 納米粒單因素考察結(jié)果（n=3）

2.3 星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化CuS 納米粒處方工藝

在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計（central composite design, CCD），選擇上述篩選出的三個因素：水浴溫度（X1）、PVP 濃度（X2）、Cu:S（X3）為考察因素，粒徑（Y1）為評價指標(biāo)，進(jìn)行三因素五水平的星點設(shè)計。

2.3.1 星點設(shè)計結(jié)果

星點實驗設(shè)計的因素、水平及代碼值如表2 所示，實驗設(shè)計與結(jié)果如表3 所示。

表2 星點設(shè)計因素和水平

表3 星點設(shè)計實驗安排表和結(jié)果(n=3)

2.3.2 模型擬合

采用Design expert 8.0.6，將各影響因素（X1、X2、X3）和評價指標(biāo)（Y1）進(jìn)行二次多項式模型擬合，方程如下：

Y1=4.15-0.0086X1-0.18X2+0.42X3-0.045X1X2+0.064X1X3-0.17X2X3+0.043X12+0.17X22-0.22X32

此時二項式模型達(dá)顯著水平（P=0.006 5），r=0.9129，說明該方程與實際情況擬合度良好。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化及預(yù)測性評價

根據(jù)表3 結(jié)果，繪制水浴溫度（X1）、PVP 濃度（X2）及Cu:S（X3）對粒徑（Y1）的響應(yīng)面。

根據(jù)圖1 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定最優(yōu)參數(shù)為：水浴溫度100 ℃，PVP 濃度為100 mg/ml，Cu∶S為1∶3。按照最優(yōu)處方工藝平行制備3 份樣品，粒 徑 分 別 為9.37、12.39、9.84 nm，平 均 值 為（10.53±1.63）nm，預(yù)測值為10.86 nm，根據(jù)公式：偏差=（預(yù)測值-實際值）/預(yù)測值×100%，得出實際值與預(yù)測值的偏差為3.04%，說明建立的數(shù)學(xué)模型較為可靠，預(yù)測性良好。

2.4 CuS 納米粒的體外評價

2.4.1 納米粒形態(tài)

取CuS 納米粒適量，加去離子水稀釋10 倍，取5 μl 稀釋后的CuS 納米粒，滴于縛有碳支持膜的銅網(wǎng)上，銅網(wǎng)下鋪濾紙，用于吸去多余的液體。自然晾干后，用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope, TEM）觀察納米粒形態(tài)。圖2結(jié)果顯示，CuS 納米粒形態(tài)圓整，分散性良好，經(jīng)Image J 軟件測量，平均粒徑為（3.10±0.81）nm。

2.4.2 粒徑穩(wěn)定性

將CuS 納米粒分別放置在4 ℃與25 ℃條件下，定時測定粒徑。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，20 d 內(nèi)CuS 納米粒的粒徑變化沒有明顯差異，說明所制的CuS 納米粒具有良好的粒徑穩(wěn)定性（圖3）。

2.4.3 光熱效應(yīng)

⑴近紅外光功率密度：考察CuS 納米粒濃度為50 μg /ml 條件下，不同近紅外光功率密度（0.5 、1、1.5、2 W/cm2）對CuS 納米粒光熱效應(yīng)的影響。采用980 nm 的近紅外激光器，紅外熱成像儀每隔30 s 記錄溫度，記錄10 min，平行測量3 組，繪制升溫曲線，同時，以水在相同條件下做對照。隨著功率密度增大，CuS 納米粒升溫加快（圖4），而在相同條件下，去離子水的升溫速率顯著低于CuS 納米粒（圖5）。

⑵CuS 納米粒濃度：考察在1 W/cm2功率密度下，CuS 納米粒不同濃度（25 、50 、150 、200 μg/ml）對其光熱效應(yīng)的影響，并以去離子水為空白對照。采用980 nm 的近紅外激光器，紅外熱成像儀每隔30 s 記錄溫度，記錄10 min，平行3 組，繪制升溫曲線。結(jié)果顯示，在相同功率密度條件下，CuS 納米粒濃度越大，升溫速率越大（圖6）。

2.4.4 光熱穩(wěn)定性

采用980 nm 近紅外激光器，選取CuS 濃度為50 μg /ml，激光功率密度為1 W/cm2，將激光器“開啟-關(guān)閉”4 個循環(huán)，即照射10 min 后停止，溫度恢復(fù)至室溫后再次開啟照射。如圖7 所示，CuS 納米粒經(jīng)近紅外光照射4 個循環(huán)的溫度變化曲線基本一致，即反復(fù)照射不影響CuS 納米粒的光熱效應(yīng)，表明其具有良好的光熱穩(wěn)定性。

2.5 體外細(xì)胞實驗

2.5.1 細(xì)胞毒性實驗

考察CuS 納米粒對正常人腎小管上皮細(xì)胞（HK2）以及乳腺癌細(xì)胞（4T1）的毒性。實驗前，取適量CuS 納米粒放入透析袋（MWCO=14000）中，透析24 h 以除去雜質(zhì)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整HK2 細(xì)胞濃度為1×105cells/ml，4T1 細(xì)胞濃度為5×104cells/ml，將100 μl/孔 的 細(xì) 胞 懸 液 接 種 于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。孵育24 h 后，每孔加入10 μl 不同濃度的CuS 納米粒，使終濃度分別為3.1、6.3、12.5、25、50、100、150 及200 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，去除96 孔板中培養(yǎng)基，加PBS 洗滌2 次（以排除Cu2+對CCK-8 試劑的影響），每孔加入100 μl 培養(yǎng)基及10 μl CCK-8 試劑，于培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度值（A）。參照公式：

細(xì)胞活力（%）=(A加藥-A空白)/(A0加藥-A空白)×100%，

計算細(xì)胞活力百分率，其中A加藥指具有細(xì)胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度，A空白指具有培養(yǎng)基和CCK-8 溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度，A0加藥指具有細(xì)胞、CCK-8 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

結(jié)果顯示（圖8），CuS 納米粒分別在100 μg/ml及150 μg/ml 濃度范圍內(nèi)，對4T1 乳腺癌細(xì)胞以及HK2 腎細(xì)胞均無顯著的細(xì)胞毒性（細(xì)胞活力大于80%），表明CuS 納米粒具備良好的生物相容性。

2.5.2 光熱效應(yīng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

考察CuS 納米粒的光熱效應(yīng)對4T1 細(xì)胞的殺傷作用。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整4T1 細(xì)胞濃度為5×104cells/ml，將200 μl/孔 細(xì) 胞 懸 液 接 種 于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，去除全部培養(yǎng)基，加入200 μl 含CuS 納米粒的培養(yǎng)基（CuS 納米粒的濃度為50 μg /ml）。采用1 W/cm2的近紅外光，照射不同時間（0、1、3、5、7、10 min），隨后采用CCK-8 試劑測定細(xì)胞活力百分率，參照“2.5.1”項下公式計算。結(jié)果顯示（圖9），近紅外光照射1 min 對4T1 細(xì)胞的活力無明顯影響，繼續(xù)延長照射時間，細(xì)胞活力呈顯著的降低趨勢，照射10 min 后的細(xì)胞活力僅為28.76 %。

采用與上述相同的方法，改為6 孔板，經(jīng)980 nm近紅外光（1 W/cm2）照射10 min 后，加入0.2 %臺盼藍(lán)對死細(xì)胞進(jìn)行染色（2 min）。去除染液并用PBS 清洗2 遍后，在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行觀察。如圖10 所示，激光照射區(qū)域，細(xì)胞被染為藍(lán)綠色，且顯示了明顯的邊界，而對照組不加CuS 納米粒，僅給予近紅外光照射，只有個別零散的細(xì)胞著色。圖9 與圖10 結(jié)果均表明CuS 納米粒對腫瘤細(xì)胞具有顯著的光熱殺傷效果。

3 討論

目前光熱治療作為新型的腫瘤治療技術(shù)，尋找合適的光敏劑是亟待解決的重要問題。光熱穩(wěn)定、價格低廉等是CuS 納米粒的主要優(yōu)點，但目前文獻(xiàn)所報道的CuS 納米粒粒徑多在10 nm 以上[12-13]，可能引起CuS 納米粒在體內(nèi)的蓄積，將限制其在臨床上的使用，而減小粒徑可以有效解決這個問題。本研究經(jīng)單因素考察和星點設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化法，得到CuS 納米粒的最優(yōu)處方工藝，成功制備實際粒徑為（3.10±0.81）nm 的CuS 納米粒，且制備方法簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。該處方中以PVP 作為保護劑，使CuS 納米粒具有良好的粒徑穩(wěn)定性，分散度高，不易發(fā)生聚集沉淀，單因素考察分析也可發(fā)現(xiàn)PVP 濃度對CuS 納米粒粒徑具有較大影響，PVP 濃度低，CuS 納米粒容易發(fā)生聚集，粒徑增大；濃度太高，保護層過厚，也會引起CuS 納米粒粒徑增大，因此選擇合適的PVP 濃度，是控制CuS 納米粒粒徑關(guān)鍵因素之一。

由于CuS 納米粒在近紅外區(qū)域（700～1 400）nm具有強吸收，使其在近紅外光照射下，具有較強的光熱效應(yīng)，所優(yōu)選的CuS 納米粒在1 W/cm2的激光功率密度下，照射4 min，溫度即可達(dá)到42 ℃以上，可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡或壞死[14]。因CuS 納米粒的光熱轉(zhuǎn)換性能來源于Cu2+的d-d 能級躍遷，不易受外界環(huán)境的影響，所優(yōu)選的CuS 納米粒具有良好的光熱穩(wěn)定性。本實驗所優(yōu)選的CuS 納米粒生物相容性好，且對腫瘤細(xì)胞具有顯著的光熱殺傷作用，這與多數(shù)文獻(xiàn)報道相一致[15-16]。

綜上，本研究所制備的CuS 納米粒粒徑有望解決CuS 納米粒體內(nèi)蓄積的問題，使其更好地應(yīng)用于腫瘤光熱治療。本課題將進(jìn)一步研究所制硫化銅納米粒在體內(nèi)的代謝情況以及對腫瘤組織的光熱殺傷效果。