基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究柴胡達(dá)胸合劑治療新型冠狀病毒肺炎的作用機(jī)制

肖志軍，劉萃萃，陸賽花，蔡 建，徐 峰 （上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院：. 藥劑科, . 檢驗(yàn)科，上海201499）

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是指2019 年始發(fā)、由嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2 型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的肺炎。截至2020 年4 月5 日，全球共確診COVID-19 患者1 093 349 例，死亡58 620 例[1]。目前尚無(wú)針對(duì)COVID-19 的特異性治療藥物，一些化學(xué)藥物包括氯喹/羥氯喹、洛匹那韋/利托那韋、瑞德西韋等正在臨床開(kāi)展隨機(jī)對(duì)照研究。臨床實(shí)踐表明，清肺排毒湯和連花清瘟膠囊等多種中藥方劑和制劑對(duì)COVID-19 有良好的治療效果。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)報(bào)道，在我國(guó)確診的COVID-19 病例中，有74 187 人使用了中醫(yī)藥，占91.5%；中醫(yī)藥能夠緩解癥狀，減少輕型、普通型疾病向重型發(fā)展，提高治愈率、降低病死率，總有效率達(dá)90%以上[2]。

柴胡達(dá)胸合劑，曾用名為“強(qiáng)力肺炎1 號(hào)”，是國(guó)醫(yī)大師梅國(guó)強(qiáng)教授為痰熱壅肺證COVID-19 患者制定的中藥處方[3]。柴胡達(dá)胸合劑由小柴胡湯、小陷胸湯、達(dá)原飲、止嗽散共同組方，包含柴胡、黃芩、法半夏、全瓜蔞、黃連、枳實(shí)、甘草、浙貝母、桔梗、百部、前胡、紫苑、款冬花、檳榔、草果、藿香、佩蘭、虎杖共十八味中藥。由于臨床使用療效顯著，2020 年2 月23 日，湖北省藥品監(jiān)督管理局下發(fā)制劑備案批件，包括柴胡達(dá)胸合劑在內(nèi)的2 個(gè)由湖北省中醫(yī)院研制的醫(yī)院制劑獲批用于防治COVID-19[4]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)技術(shù)和方法，通過(guò)構(gòu)建“藥物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)，分析藥物在網(wǎng)絡(luò)中與特定節(jié)點(diǎn)相互作用的關(guān)系，從整體角度探索藥物與機(jī)體相互作用的一門(mén)學(xué)科[5]。2007 年，Hopkins 首次在Nature Biotechnology雜志上發(fā)表述評(píng)，提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一概念，并認(rèn)為其為發(fā)現(xiàn)新藥的新范式[6]。中藥通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路對(duì)疾病產(chǎn)生治療作用，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，可系統(tǒng)闡明中藥治療疾病的藥理作用機(jī)制[7]。

因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的活性成分和作用靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，然后對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction, PPI）、GO 基因注釋和KEGG 信號(hào)通路分析，為進(jìn)一步闡明柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的藥理作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 柴胡達(dá)胸合劑藥材的性味歸經(jīng)、活性成分和靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 年版）手工檢索柴胡達(dá)胸合劑的十八味中藥材的性味歸經(jīng)，利用Cytoscape 3.7.2 軟件制作“藥材-性味歸經(jīng)”網(wǎng)絡(luò)圖。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）以柴胡達(dá)胸合劑中的十八味中藥材名為關(guān)鍵詞檢索得到所有中藥的化學(xué)成分。生物利用度（oral bioavailability，OB）和半衰期（half life，HL）是影響藥動(dòng)學(xué)的重要參數(shù)，而類(lèi)藥性（druglikeness，DL）可以反映化合物的理化性質(zhì)與已上市的藥物是否類(lèi)似。根據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)推薦的篩選標(biāo)準(zhǔn)，本研究以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 及HL≥4 h為條件，篩選得到每味中藥材的活性成分。同時(shí)，通過(guò) TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查找各活性成分的作用靶點(diǎn)，歸納整理后利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)名稱(chēng)。

1.2 “藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

以coronavirus 為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得COVID-19 潛在相關(guān)基因；利用Venn 圖在線繪制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），將柴胡達(dá)胸合劑活性成分的作用靶點(diǎn)和COVID-19 相關(guān)基因取交集，得到柴胡達(dá)胸合劑治療 COVID-19 作用靶點(diǎn)；最后，將得到的藥材-活性成分-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)性文本導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建并分析“藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將柴胡達(dá)胸合劑治療 COVID-19 作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)（https://stringdb.org/），物種選定為Homo sapiens，獲得PPI 信息并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，利用NetworkAnalyzer功能，分析網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)靶點(diǎn)的度值（dgree value），使用R 軟件Graphics 包，繪制條形圖展示度值排名前20 位的靶點(diǎn)。

1.4 GO 基因注釋和KEGG 通路分析

利用R 軟件的org.Hs.eg.db 和clusterProfiler包，對(duì)柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 基因注釋和KEGG 通路分析，以P＜0.05 進(jìn)行篩選，得到柴胡達(dá)胸合劑對(duì)COVID-19 發(fā)揮治療作用參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，并繪制氣泡圖展示結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 柴胡達(dá)胸合劑的藥材性味歸經(jīng)

柴胡達(dá)胸合劑“藥材-性味歸經(jīng)”網(wǎng)絡(luò)如圖1 所示，圖中節(jié)點(diǎn)的大小代表該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的度值。由圖可知，度值最大的性味歸經(jīng)分別為寒（度值=8）、苦（度值=13）和肺經(jīng)（度值=14）。

2.2 柴胡達(dá)胸合劑的活性成分及其作用靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP 平臺(tái)檢索到柴胡達(dá)胸合劑中的十八味藥材共包含1 977 個(gè)化合物。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 及HL≥4 h 為條件篩選并去重后，共得到221 個(gè)活性成分。在TCMSP 檢索活性成分的作用靶點(diǎn)，并到Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找其標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)，最后共得到259 個(gè)作用靶點(diǎn)。柴胡達(dá)胸合劑的“中藥-化合物-活性成分-靶點(diǎn)”信息，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 柴胡達(dá)胸合劑治療 COVID-19 的作用靶點(diǎn)

通過(guò)檢索GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)，共收集得到COVID-19 相關(guān)基因352 個(gè)。將柴胡達(dá)胸合劑的作用靶點(diǎn)和COVID-19 相關(guān)基因取交集制作Venn 圖，共得到51 個(gè)交集基因，即柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的作用靶點(diǎn)（圖2）。

2.4 “藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19“藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)共包含234 個(gè)節(jié)點(diǎn)（藥材節(jié)點(diǎn)18 個(gè)，有效成分節(jié)點(diǎn)165 個(gè)，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)51 個(gè)）。網(wǎng)絡(luò)中棱形代表藥材節(jié)點(diǎn)，倒三角代表有效成分節(jié)點(diǎn)，圓形代表靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)（圖3）。節(jié)點(diǎn)的顏色越深或節(jié)點(diǎn)圖形越大，表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的度值越高。每一圈的最低點(diǎn)為該圈度值最大的節(jié)點(diǎn)，度值沿逆時(shí)針?lè)较蛑饾u減小，且3 個(gè)有效成分節(jié)點(diǎn)圈由外往里節(jié)點(diǎn)度值依次減小。網(wǎng)絡(luò)中化合物節(jié)點(diǎn)中位數(shù)為4，高于2 倍中位數(shù)的化合物節(jié)點(diǎn)共有12 個(gè)（表2），這些化合物可能是柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的主要活性成分。

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)

在“藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)不包含PPI 信息，因此，對(duì)柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 分析，結(jié)果如圖4A 所示。圖中節(jié)點(diǎn)形狀越大，表明其度值越高，越可能為柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的核心作用靶點(diǎn)。對(duì)網(wǎng)絡(luò)中度值前30 的節(jié)點(diǎn)作條形圖，節(jié)點(diǎn)度值排名前10 的蛋白為CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2和CCL2（圖4B）。

表1 柴胡達(dá)胸合劑的“中藥-化合物-活性成分-靶點(diǎn)”信息表

2.6 GO 基因注釋

GO 基因注釋將基因的功能分為3 個(gè)部分：參與的生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP），所處的細(xì)胞組分（cellular component，CC），執(zhí)行的分子功能（molecular function，MF）。對(duì)柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的51 個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 基因注釋?zhuān)訮＜0.05 為條件進(jìn)行篩選，結(jié)果得到GO 條目共1 722 個(gè)，其中BP 條目1 612 個(gè)，CC 條目30 個(gè)，MF 條目80 個(gè)。選取每個(gè)部分的前5 個(gè)條目作氣泡圖，富集最多基因且P值最小的BP、CC 和MF 條目分別為脂多糖反應(yīng)、膜筏和細(xì)胞因子受體結(jié)合（圖5）。

2.7 KEGG 信號(hào)通路分析

對(duì)柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的51 個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行 KEGG 信號(hào)通路富集分析，篩選出P＜0.05 的信號(hào)通路156 條，選取富集基因最多的10 條通路作氣泡圖。排名前5 的信號(hào)通路為糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、甲型流感、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路和乙型肝炎（圖6）。

3 討論

COVID-19 隸屬于中醫(yī)的“溫疫”、“疫病”范疇，病因?yàn)楦惺堋爱悮狻?、“癘氣”，癘氣夾濕，病位在肺、脾[3]。柴胡達(dá)胸合劑用于痰熱壅肺證患者，其病因?yàn)樘禑峄ソY(jié)，壅閉于肺，致使肺失宣降而表現(xiàn)的肺經(jīng)實(shí)熱證候。本研究首先對(duì)柴胡達(dá)胸合劑的十八味中藥材進(jìn)行性味歸經(jīng)的網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡達(dá)胸合劑組方的性味以“苦寒”最多且主歸肺經(jīng)?！翱嗪彼幠芮鍩釣a火，消除熱癥，多用于具有實(shí)熱特征病證[8]。因此，柴胡達(dá)胸合劑與COVID-19 的病機(jī)、病位相符。

利用中藥、疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究篩選出柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的165 個(gè)活性成分和51 個(gè)作用靶點(diǎn)，表明柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。通過(guò)構(gòu)建和分析“藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中度值較高的12 個(gè)活性成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素、甘草查爾酮A、刺槐素、川陳皮素、異鼠李素和葛花苷元。除β-谷甾醇外，其余11 個(gè)成分均屬于黃酮類(lèi)化合物。

表2 高于2 倍度值中位數(shù)的化合物信息表

黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于自然界的多種植物中，具有包括抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗腫瘤等多種藥理作用[9]。黃酮類(lèi)化合物還有良好的抗病毒作用，對(duì)流感病毒、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒和柯薩奇病毒等都有抑制作用[10]。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，槲皮素和木犀草素均能夠抑制SARS-CoV 3CL 蛋白酶活性，對(duì)SARS-CoV 產(chǎn)生抑制作用[11-12]。β-谷甾醇也能抑制SARS-CoV 3CL 蛋白酶活性[13]。SARS-CoV-2 與SARS-CoV 基因序列有約80%同源性，兩者3CL 蛋白酶結(jié)構(gòu)有相似性[14]。此外，分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)山柰酚、槲皮素、 黃芩素、 木犀草素、 漢黃芩素、β-谷甾醇與SARS-CoV-2 3CL 蛋白酶均有較高的結(jié)合活性[15]。因此，通過(guò)直接抑制SARS-CoV-2 3CL 蛋白酶活性，可能是柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的藥理作用機(jī)制之一。

通過(guò)分析PPI 網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，CASP3、MAPK3、IL-6、 MAPK8、 IL-10、 CXCL8、 MAPK1、 IL-1B、PTGS2、CCL2 等在網(wǎng)絡(luò)中有較高的度值。CASP3 基因編碼的caspase-3 蛋白是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要的終末剪切酶，研究發(fā)現(xiàn)caspase-3 蛋白在SARS-CoV 病毒引起的組織細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[16]。MAPK 基因編碼的絲裂原活化蛋白激酶參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移及凋亡等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。此外，炎癥因子風(fēng)暴被認(rèn)為是重癥COVID-19 患者組織損傷的病理機(jī)制之一。SARSCoV-2 病毒在體內(nèi)激活T 細(xì)胞，產(chǎn)生粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6 等細(xì)胞因子，隨后GM-CSF 會(huì)進(jìn)一步激活CD14+CD16+炎性單核細(xì)胞，進(jìn)一步升高IL-6 等炎性因子，形成炎癥因子風(fēng)暴，導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部和其他器官免疫損傷[17]。細(xì)胞因子根據(jù)其在炎性反應(yīng)中的作用不同可分為促炎性細(xì)胞因子（如 IL-1、IL-6、IFN-α、IFN-γ、TNF-α 等）和抑炎性細(xì)胞因子（如 IL-4、IL-10 等）兩類(lèi)。SARS 患者的肺部炎癥和肺損傷與患者血漿中的IL-1B、IL-6、IL-12 等促炎性細(xì)胞因子水平升高引起炎癥因子風(fēng)暴有關(guān)[18]。同樣地，COVID-19 患 者 血 漿IL-1B、IFN-γ、CXC 趨 化 因 子-10（CXCL-10）等促炎性細(xì)胞因子水平也升高[19]。本研究中，IL-6、IL-10 和IL-1B 均為核心作用靶點(diǎn)。因此，減少組織細(xì)胞凋亡、降低促炎性細(xì)胞因子和升高抑炎性細(xì)胞因子水平可能也是柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的藥理作用機(jī)制。

對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 基因注釋的結(jié)果表明，柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 的主要生物學(xué)過(guò)程為脂多糖反應(yīng)、對(duì)源于細(xì)菌的分子的反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等。脂多糖是G-菌細(xì)胞壁的組成成分，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，其中促炎性細(xì)胞因子發(fā)揮了重要介導(dǎo)作用。IL-6 可促進(jìn)B 細(xì)胞分化，并活化MAPK，激活STAT 轉(zhuǎn)錄因子，從而加重炎性反應(yīng)[20]。KEGG 分析富集到156 條信號(hào)通路，主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、甲型流感、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路和乙型肝炎，表明柴胡達(dá)胸合劑治療COVID-19 多通路的特點(diǎn)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步揭示了柴胡達(dá)胸合劑可能一方面通過(guò)多種黃酮類(lèi)化合物和β-谷甾醇直接抑制SARS-CoV-2 3CL 蛋白酶活性，另一方面通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路減少組織細(xì)胞凋亡、降低促炎性細(xì)胞因子和升高抑炎性細(xì)胞因子水平，從而對(duì)COVID-19 產(chǎn)生治療作用。