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    臍血與老人外周血中TIMP2蛋白檢測(cè)的影響因素及意義

    2019-09-17 12:31:14曾桂芳曾偉杰蔡菲子胡樾張沁坤梁曉劉沐蕓
    關(guān)鍵詞:臍血離心力外周血

    曾桂芳 曾偉杰 蔡菲子 胡樾 張沁坤 梁曉 劉沐蕓

    干細(xì)胞是具有自我更新以及多能分化潛力的一類(lèi)細(xì)胞[1]。由于干細(xì)胞類(lèi)型較多,來(lái)源廣泛,在人體內(nèi)相對(duì)容易獲得,結(jié)合它們有更新和分化的潛能,因此具有很高的研究?jī)r(jià)值,特別是針對(duì)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UCMSC)和脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cell,ADSC)等,在再生醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞組織的再生以及損傷修復(fù)。衰老是生物體必經(jīng)的生理過(guò)程,伴隨著細(xì)胞的功能及活性逐漸發(fā)生衰減,細(xì)胞結(jié)構(gòu)也隨著衰老進(jìn)程發(fā)生明顯的變化。而具有多能分化和自我更新等優(yōu)點(diǎn)的干細(xì)胞便成為對(duì)抗衰老,延緩衰老進(jìn)程發(fā)展的首要研究目標(biāo)。在多項(xiàng)抗衰老的初步研究中,不同來(lái)源的干細(xì)胞,如骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、ADSC、真皮間充質(zhì)干細(xì)胞等也能直接或間接發(fā)揮抗衰老作用。此類(lèi)干細(xì)胞能夠更新已經(jīng)衰老的細(xì)胞,增強(qiáng)細(xì)胞已經(jīng)衰減的功能,通過(guò)自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生游離的各種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子,改善衰老細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境,清除各種因細(xì)胞功能衰退累積的代謝廢物、毒素或氧自由基等,促進(jìn)細(xì)胞的更新和再生[2]。因此,在對(duì)抗衰老或延緩衰老的治療中,干細(xì)胞常被用作原料藥或輔藥加以使用[3]。

    新生兒臍血與外周血是兩種不同成分的血液,血漿成分存在很大差異,其干細(xì)胞數(shù)量或其它細(xì)胞亞群數(shù)量[4]、血液中的細(xì)胞因子存在的種類(lèi)[5]、血漿中不同蛋白的含量均有所不同,甚至到了老年期,外周血的血漿對(duì)比臍血血漿更是存在明顯差異。相對(duì)于外周血而言,臍血中富含較多的CD34+HSC,這是一類(lèi)原始的造血細(xì)胞,自身的異質(zhì)性已經(jīng)具有更新和多普系分化能力,血液中存在的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞等均由HSC分化產(chǎn)生,能持續(xù)不斷的為機(jī)體血液中提供新產(chǎn)生的血細(xì)胞,有研究表示增強(qiáng)HSC的功能能增強(qiáng)抗衰老的能力[6],所以富含HSC的臍血中具有一定抗衰老的作用。而作為機(jī)體內(nèi)最大的催化酶,且為金屬蛋白酶家族的成員基質(zhì)金屬蛋白酶,具有維持細(xì)胞外基質(zhì)平衡的作用,能特異性的與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)共價(jià)結(jié)合。

    TIMPs共有4種蛋白,包括TIMP1~TIMP4[7],其中,TIMP2蛋白約22 kDa,包含194個(gè)氨基酸殘基[8],作為可溶性的蛋白存在于機(jī)體血液中,或結(jié)合在特定的細(xì)胞膜上。有臨床研究顯示,TIMP2蛋白與癌癥的發(fā)生存在相關(guān)性,并在癌癥的提前診斷或某些器官的損傷診斷中提供參考指標(biāo)[9-10]。在人臍血中,TIMP2蛋白被證實(shí)能提高小鼠海馬體的活性,導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)能力和空間探索能力增強(qiáng)[11],而且在不同生理時(shí)期血漿中游離的TIMP2蛋白含量存在差異,預(yù)示著人血漿中TIMP2蛋白的含量可能伴隨著人的生長(zhǎng)發(fā)育或者生老病死,利用這些潛在的作用,血漿中TIMP2蛋白同樣具有針對(duì)延緩衰老的研究?jī)r(jià)值,讓利用臍血血漿聯(lián)合干細(xì)胞抗擊衰老成為可能。但是,對(duì)于不同生理時(shí)期中的人血漿中TIMP2含量檢測(cè)并沒(méi)有報(bào)道,而且也沒(méi)有一套成熟完善的人血漿TIMP2檢測(cè)方法,不同的血液處理方式會(huì)直接影響TIMP2蛋白的檢測(cè)結(jié)果。因此,本研究針對(duì)新生兒臍血和老人外周血兩組年齡的血漿,為了能更準(zhǔn)確的反應(yīng)機(jī)體當(dāng)前的TIMP2含量,建立一套穩(wěn)定的血漿TIMP2蛋白檢測(cè)方法,同時(shí)對(duì)比臍血和老人外周血血漿中TIMP2蛋白的含量,了解TIMP2蛋白在這兩個(gè)時(shí)期的含量差異,不僅為后續(xù)TIMP2蛋白臨床研究者提供借鑒,也為T(mén)IMP2蛋白聯(lián)合干細(xì)胞治療并延緩衰老的可能性研究提供參考。

    材料與方法

    一、材料

    (一)新生兒臍帶血

    采集前獲得產(chǎn)婦及其家屬的知情和同意,并簽訂知情同意書(shū),詳細(xì)詢(xún)問(wèn)了產(chǎn)婦的妊娠史及遺傳病史,產(chǎn)婦年齡不低于20歲,不高于40歲,孕齡不低于36周;胎兒性別不限,體重大于2 500 g且無(wú)畸形、感染和先天性疾病等;對(duì)采集的臍血進(jìn)行人類(lèi)免疫缺陷病毒、梅毒、乙肝表面抗原及丙型肝炎病毒檢測(cè)。凡是不符合以上條件的臍血均不予以采集。共采集15份,平均采集量為57 g,利用5 ml真空采血管采集。

    (二)老人外周血

    采集前獲得捐贈(zèng)者的知情和同意,并簽訂知情同意書(shū),詳細(xì)詢(xún)問(wèn)捐贈(zèng)者的病史、遺傳病史,捐贈(zèng)年齡不低于60周歲,不高于80周歲,性別不限;無(wú)傳染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤相關(guān)疾病等;對(duì)采集的外周血進(jìn)行人類(lèi)免疫缺陷病毒、梅毒、乙肝表面抗原及丙型肝炎病毒檢測(cè);凡是不符合以上條件的老人外周血均不予以采集。共采集15份,平均采集量為60 g,利用5 ml真空采血管采集。

    (二)主要儀器和試劑

    日本久保田離心機(jī),海爾低溫冰箱,TIMP2 Human ELISA檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司、美國(guó)Abnova公司和英國(guó)Abcam公司。

    二、方法

    (一)不同離心力中TIMP2蛋白含量的檢測(cè)

    取新鮮采集到的5份臍帶血和5份老人外周血,收集于50 ml離心管,立即置于離心機(jī)中進(jìn)行離心,分別用1 000×g、1 500×g、2 000×g三種不同的離心力進(jìn)行離心15 min,收集上層的全部血漿于50 ml離心管,避免收集到紅細(xì)胞,立即利用R&D Quantikine ELISA Human TIMP-2檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TIMP2含量。

    (二)不同保存溫度中TIMP2蛋白含量的檢測(cè)

    另取新鮮的5份臍帶血和5份老人外周血,收集于50 ml離心管,立即進(jìn)行2 000×g離心15 min,分離血漿和紅細(xì)胞,收集上層血漿于50 ml離心管,分別置于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃保存一周,利用R&D Quantikine ELISA Human TIMP-2檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TIMP2含量。

    (三)不同試劑盒中TIMP2蛋白含量的檢測(cè)

    另取新鮮的5份臍帶血和5份老人外周血,收集于50 ml離心管,立即進(jìn)行2 000×g離心15 min,分離血漿和紅細(xì)胞,收集上層血漿于50 ml離心管,分別采用R&D systems、Abnova、Abcam三種不同的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒進(jìn)行TIMP2蛋白含量檢測(cè)。

    1. R&D systems TIMP-2 ELISA法:血漿樣本用稀釋液稀釋50倍,加入1 ml滅菌超純水,混勻,以RD5P稀釋液配制10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156 ng/ml梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液,每孔加入100 μl TIMP2抗體和50 μl稀釋后的血清,室溫孵育2 h,棄上清加入400 μl洗液洗4次,每孔加入200 μl生物素偶聯(lián),室溫2 h,洗板4次,200 μl底物試劑避光30 min,50 μl終止液,酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè),計(jì)算TIMP2蛋白含量。

    2. Abnova TIMP-2 ELISA法:配制10 000、5 000、2 500、1 250、625、312、156 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液,與樣本血漿及空白對(duì)照各100 μl分別加入96孔板中,37 ℃水浴90 min,加入100 μl TIMP2抗體,37 ℃水浴60 min,棄上清,PBS洗滌3次,每孔加入100 μl 提前水浴30 min,稀釋100倍后的二抗,37 ℃水浴30 min,棄液,洗滌5次,每孔加入90 μl顯色試劑,避光37 ℃孵育25 min,加入100 μl終止液終止顯色,酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。

    3. Abcam TIMP-2 ELISA法:配制12 000、400、133.3、44.4、14.8、4.9、1.6 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液,與樣本血漿及空白對(duì)照各100 μl分別加入96孔板中,室溫孵育2.5 h,棄上清,每孔300 μl PBS洗滌4次,每孔加入100 μl TIMP2抗體,室溫1 h,洗滌4次,每孔加入100 μl HRP辣根過(guò)氧化物酶,溶液室溫45 min,洗滌4次,每孔加入100 μl 底物溶液,室溫30 min,每孔加入50 μl 終止液,酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

    利用Graph prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,各組TIMP2蛋白數(shù)據(jù)以± s表示。兩組均數(shù)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組均數(shù)間差異比較采用單因素方差分析,以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、離心力對(duì)TIMP2蛋白含量的影響

    利用1 000×g、1 500×g、2 000×g三種離心力,了解不同離心力對(duì)全血中TIMP2蛋白沉降的影響。結(jié)果顯示,不同離心力無(wú)論對(duì)臍血還是老人外周血中的TIMP2含量均無(wú)顯著影響,每毫升血液中的TIMP2蛋白含量相當(dāng)(表1)。

    表1 不同離心力對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響(± s)

    表1 不同離心力對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響(± s)

    離心力樣本數(shù)臍血(ng/ml)老人外周血(ng/ml)1 000×g5147.23±22.5991.36±5.19 1 500×g5147.64±18.3287.70±6.97 2 000×g5145.27±20.5789.25±5.63 F值0.0021.321 P值> 0.05> 0.05

    二、保存溫度對(duì)TIMP2蛋白的影響

    2 000×g離心后的血漿分別置于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃保存一周和兩周后,了解不同血漿儲(chǔ)存溫度對(duì)TIMP2蛋白的影響。結(jié)果顯示,在血漿保存一周時(shí),不同保存溫度無(wú)論對(duì)臍血還是老人外周血中的TIMP2含量均無(wú)顯著影響,每毫升血液中的TIMP2蛋白含量相當(dāng);在血漿保存到第二周時(shí),- 20 ℃和-80 ℃保存的血漿檢測(cè)TIMP2蛋白含量依舊相當(dāng),但是4 ℃組對(duì)比第1周的結(jié)果出現(xiàn)TIMP2蛋白檢測(cè)值輕微下降,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。因此,第1周內(nèi)的血漿儲(chǔ)存檢測(cè)到的TIMP2蛋白含量的數(shù)值會(huì)更接近原始血液中的真實(shí)值(表2,3)。

    表2 不同溫度保存血漿1周對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響(± s)

    表2 不同溫度保存血漿1周對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響(± s)

    溫度樣本數(shù)臍血(ng/ml)老人外周血(ng/ml) 4℃5148.40±18.5070.65±11.38-20℃5151.27±18.7073.00±10.48-80℃5150.00±16.8272.42±11.59 F值0.0890.169 P值> 0.05> 0.05

    表3 不同溫度保存血漿2周對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響(± s)

    表3 不同溫度保存血漿2周對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響(± s)

    溫度樣本數(shù)臍血(ng/ml)老人外周血(ng/ml) 4℃5145.35±22.2566.99±10.58-20℃5151.59±19.6272.31±12.41-80℃5149.15±17.9071.22±13.12 F值0.3460.756 P值> 0.05> 0.05

    三、不同ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果

    分別利用市面上三大廠商的ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)臍血和老人外周血的TIMP2含量,優(yōu)選出精準(zhǔn)和操作簡(jiǎn)單方便的TIMP2蛋白檢測(cè)試劑盒。結(jié)果顯示,R&D systems、Abnova和Abcom的3款檢測(cè)試劑和檢測(cè)結(jié)果無(wú)論是臍血還是老人外周血均相近,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外,對(duì)比操作時(shí)長(zhǎng),Abcom試劑盒檢測(cè)所需總時(shí)長(zhǎng)最短,其次是R&D systems,對(duì)比整個(gè)操作的復(fù)雜程度,R&D systems相對(duì)最簡(jiǎn)單,其次是Abcom(表4)。

    表4 不同ELISA試劑盒對(duì)TIMP蛋白檢測(cè)的影響(± s)

    表4 不同ELISA試劑盒對(duì)TIMP蛋白檢測(cè)的影響(± s)

    試劑盒樣本數(shù)臍血(ng/ml)老人外周血(ng/ml)R&D5144.73± 8.2276.80± 8.98 Abnova5145.25±11.8077.17±11.34 Abcom5142.95±16.0176.76±11.58 F值0.1310.774 P值> 0.05> 0.05

    四、不同來(lái)源的血漿TIMP2蛋白含量比較

    將采集到的15份新生兒臍血和15份老人外周血進(jìn)行TIMP2蛋白含量的比較,將采集到的30份樣本全部統(tǒng)一采用2 000×g離心力分離血漿,均利用R&D Systems TIMP2的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果所示,新生兒臍血血漿中TIMP2蛋白含量高于老人外周血中的,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),且新生兒臍帶血中TIMP2含量均高于120ng/ml,老人外周血中的TIMP2蛋白含量均低于100ng/ml,證明老人外周血中的TIMP2含量相比于臍血出現(xiàn)了明顯的降低,新生兒時(shí)期和年老時(shí)期的人血漿TIMP2蛋白存在明顯差異,預(yù)示著TIMP2蛋白含量與衰老存在直接的關(guān)系,隨著年齡的增長(zhǎng)到年老期,TIMP2蛋白因某種原因?qū)е滤p(表5)。

    表5 臍血和老人外周血TIMP2蛋白含量比較(± s)

    表5 臍血和老人外周血TIMP2蛋白含量比較(± s)

    血液類(lèi)型樣本數(shù)TIMP2蛋白含量(ng/ml)臍血15144.73±8.22老人外周血15 76.80±8.98 F值174.042 P值< 0.01

    討 論

    衰老被視為是一種復(fù)雜的,涉及整個(gè)機(jī)體的病理發(fā)展過(guò)程[12-13],伴隨端??s短、細(xì)胞自噬清除活性降低、線粒體機(jī)能下降和細(xì)胞呈現(xiàn)衰老等一系列特征表象[14-16],同時(shí)出現(xiàn)表層皮膚代謝緩慢導(dǎo)致的色素沉淀、肌纖維伸縮性降低導(dǎo)致的萎縮和神經(jīng)元細(xì)胞減少導(dǎo)致的記憶力衰退等現(xiàn)象[17]。小鼠衰老模型顯示,移植了干細(xì)胞的衰老老鼠,改善了小鼠機(jī)體抗氧化能力,通過(guò)分泌更多的細(xì)胞因子促進(jìn)衰老細(xì)胞的更新[18],如VEGF、EGF、bFGF、IGF等,加速血管及微小毛細(xì)血管的再生,增加了小鼠皮膚的厚度和皮膚中膠原蛋白的含量[19],干細(xì)胞的移植在衰老的治療中起重要作用。另外,研究指出了臍血中的TIMP2蛋白有能力提高海馬體的功能和活性,成為海馬體神經(jīng)元可塑性的重要因子[11],而海馬體又是機(jī)體對(duì)認(rèn)知和記憶的關(guān)鍵區(qū)域,無(wú)疑表明,TIMP2蛋白也許能對(duì)抗或延緩機(jī)體因衰老導(dǎo)致的記憶和認(rèn)知的衰退。因此,結(jié)合干細(xì)胞的抗衰老作用與TIMP2蛋白潛在的抗衰老能力,聯(lián)合干細(xì)胞與TIMP2蛋白的治療方式值得進(jìn)行更深入的嘗試。

    在此前景上,明確對(duì)比了影響血漿中TIMP2蛋白檢測(cè)的影響因素,了解到臍血和老人外周血TIMP2蛋白含量差異,利用不同的離心力、保存溫度及檢測(cè)試劑盒分別評(píng)估了這些因素對(duì)新生兒臍血和老人外周血中TIMP2蛋白含量的影響。其中,采用1 000×g到2 000×g間的離心力均完全分離血漿和紅細(xì)胞,對(duì)TIMP2蛋白無(wú)顯著影響,但由于低于1 000×g的離心力會(huì)降低紅細(xì)胞的沉淀率,導(dǎo)致離心效果不佳,故沒(méi)有檢測(cè)未完全分離的全血TIMP2含量。另外,本研究利用的是真空采血管采集血液樣本,而不是使用更方便采集血液的采血袋,因采血袋中含有約28 ml的枸櫞酸鈉抗凝劑,與血液混合后相當(dāng)于稀釋了血漿中TIMP2蛋白,導(dǎo)致TIMP2蛋白含量低于原始值。

    對(duì)于離心分離后的血漿無(wú)論保存在4 ℃還是-20 ℃或-80 ℃一周時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明短期的血漿保存均不會(huì)對(duì)血漿中TIMP2含量產(chǎn)生影響。在這里,4 ℃的血漿保存溫度使得TIMP2蛋白在1周內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)顯著的蛋白降解,第2周開(kāi)始,TIMP2蛋白對(duì)比第1周有出現(xiàn)檢測(cè)值的輕微下降,雖然沒(méi)有差異性,但這有可能是TIMP2蛋白具有更長(zhǎng)的半衰期,也可能是血漿復(fù)雜的成分維持了TIMP2蛋白結(jié)構(gòu)。而在臨床檢測(cè)中,為了獲得更接近機(jī)體真實(shí)數(shù)值的數(shù)據(jù),更多的是針對(duì)新鮮采集的樣本進(jìn)行檢測(cè),所以考慮到臨床檢測(cè)樣本的保存時(shí)間不會(huì)很長(zhǎng),本研究并沒(méi)有更長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)不同血漿保存時(shí)間點(diǎn)下TIMP2蛋白的變化,僅展示了第1和第2周時(shí)所檢測(cè)到的TIMP2蛋白含量。如果需要更加深入了解TIMP2蛋白的半衰期,則需要增加更長(zhǎng)時(shí)間以及更系統(tǒng)的蛋白降解的監(jiān)測(cè)。

    檢測(cè)結(jié)果表明,臍血中的TIMP2蛋白含量高于老人外周血,TIMP2蛋白含量在新生兒中已經(jīng)出現(xiàn),血漿中含量超過(guò)120 ng/ml,直到老年階段,TIMP2含量降低,低于100 ng/ml。雖然臍血中TIMP2蛋白的治療效果還未有臨床研究數(shù)據(jù),但結(jié)合血液中TIMP2蛋白具有提高小鼠海馬體活性的能力,在人體中,TIMP2蛋白也許能展現(xiàn)出對(duì)抗衰老的能力,不僅能傳遞出某些疾病的信息,同時(shí)還能反映人體衰老的水平,為臨床的判斷提供有力的參考指標(biāo),也為聯(lián)合干細(xì)胞在抗衰老的作用中提供新的思路和方向。

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