實時熒光定量 PCR檢測斑點熱立克次體方法的建立

羅婉蓉，劉伯玉，陳 振，任翠平，高 越，楊 莉，朱 禹，余東陽，柳 燕

斑點熱是一種由斑點熱群立克次體(spotted fever group rickettsiae，SFGR)感染引起、經(jīng)蜱蟲叮咬傳播的人畜共患疾病。目前國際上已證明有19種SFGR對人類有致病性[1]。國內(nèi)已鑒定的SFGR有5種：R.heilongjiangiensis、CandidatusR.tarasevichiae[2-7]。斑點熱的臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、頭痛、局部淋巴結(jié)腫大等[1]。病程早期缺乏特異性臨床癥狀，患者往往因為誤診而延誤病情，嚴(yán)重時可致死亡[8]。若患者能在早期得到快速準(zhǔn)確的診斷，并給予抗菌藥物則可以被治愈，減少死亡率。目前，斑點熱的實驗室診斷技術(shù)包括常用但缺乏特異性、敏感性的血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。其中巢式PCR與常規(guī)PCR比較具有更高的特異性[9-10]，但操作相對繁瑣。分離培養(yǎng)斑點熱立克次體是確診最直接、最可靠的依據(jù)[11]，但是耗時且有一定技術(shù)要求，難以在一般實驗室開展。因此，建立快速檢測立克次體感染的方法就顯得尤為重要。

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)技術(shù)是一種敏感特異的核酸檢測方法，可用于病毒、細(xì)菌的快速檢測[12]。該研究運用qPCR技術(shù)，根據(jù)SFGR外膜蛋白A基因(outer membrane protein A，ompA)建立SFGR的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象日本斑點熱立克次體(R.janponicaAnhui 120 strain，本實驗室分離培養(yǎng)并保存菌種)；其他立克次體屬病原體(斑疹傷寒立克次體、恙蟲病東方體、無形體)DNA以及常見非立克次體病原菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、支原體、螺旋體)DNA。

1.2 試劑及儀器PCR儀(德國Biometra公司)；實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；瓊脂糖凝膠成像儀器(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)；Nanodrop2000分光光度計(美國ThermoFisher公司)。DNeasy Blood &Tissue Kit(德國QIAGEN公司)；pMD18-T Vector Cloning Kit、Gel DNA Extraction Kit、PremixTaq、PremixExTaq、DL2000 DNA Marker(日本TaKaRa公司)，瓊脂糖凝膠(西班牙BIOWEST公司)，Plasmid Miniprep Kit(美國AXYGEN公司)。引物和探針由通用生物系統(tǒng)(安徽合肥)有限公司合成。

1.3 引物和探針的設(shè)計與合成參考GenBank中Rickettsiajaponicastrain Anhui 120ompA基因序列(序列號：KY484160.1)以及R.heilongjiangiensis054 ompA基因序列(序列號：AF179362.2)、R.raoultiistrain Khabarovsk ompA基因序列(序列號：AH015610.2)，利用Beacon Designer引物設(shè)計軟件設(shè)計斑點熱立克次體ompA基因特異性引物和探針(表1)。將設(shè)計好的引物和探針在NCBI官網(wǎng)上進(jìn)行Primer-BLAST分析，驗證該對引物和探針的特異性。

1.4 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建用DNeasy Blood&Tissue Kit提取日本斑點熱立克次體(Anhui120株)培養(yǎng)物核酸。使用本實驗常規(guī)使用的兩對巢式PCR引物(表1)擴(kuò)增斑點熱立克次體ompA基因。一輪PCR反應(yīng)體系25 μl：2×PremixTaq反應(yīng)液12.5 μl，上、下游引物(ompA-70F、ompA-701R)各0.7 μl，模板5 μl，去離子水補(bǔ)足體系。二輪PCR反應(yīng)體系25 μl：2×PremixTaq反應(yīng)液12.5 μl，上、下游引物(ompA-180F、ompA-602R)各0.7μl，模板1 μl，去離子水補(bǔ)足體系。相同的PCR反應(yīng)條件參數(shù)設(shè)置：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，51 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，39個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。配制1.2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，切膠回收目的條帶。按照pMD18-T Vector Cloning Kit說明書將ompA基因片段克隆到T載體上，并轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中。通過藍(lán)白斑篩選以及菌落PCR(表1)鑒定，篩選出含陽性重組質(zhì)粒菌液后收集菌液標(biāo)本進(jìn)行基因測序。將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析驗證，符合試驗預(yù)期的陽性重組質(zhì)粒可作為qPCR的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。大量培養(yǎng)含重組質(zhì)粒的細(xì)菌提取重組質(zhì)粒，Nanodrop2000分光光度計測量DNA濃度，計算拷貝數(shù)。將制備好的標(biāo)準(zhǔn)品分裝后置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR引物序列

1.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立按照PremixExTaq(Probe qPCR)試劑盒說明書配制20 μl的qPCR反應(yīng)體系，引物濃度0.1、0.2、0.4 μmol/L，探針濃度0.4、0.5、0.6 μmol/L進(jìn)行TaqManqPCR反應(yīng)，對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。分別以質(zhì)粒含量為1.9×108、1.9×107、1.9×106、1.9×105、1.9×104、1.9×103、1.9×102、1.9×101和1.9×100拷貝作為模板，用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增動力學(xué)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品起始濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閥值縱坐標(biāo)，推導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性檢測用優(yōu)化后的TaqManqPCR條件分別對SFGR(日本斑點熱立克次體)、立克次體科其他常見病原體(斑疹傷寒立克次體、恙蟲病東方體、無形體)、常見非立克次體病原菌 (大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、螺旋體、支原體)DNA進(jìn)行qPCR檢測。

1.7 敏感性試驗分別對質(zhì)粒含量為1.9×103、1.9×102、1.9×101、1.9×100和1.9×10-1拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，以優(yōu)化后的條件進(jìn)行TaqMan qPCR檢測，明確建立方法的最低檢測限。

1.8 重復(fù)性試驗用建立的TaqMan qPCR方法分別對質(zhì)粒含量為1.9×106、1.9×105、1.9×104、1.9×103和1.9×102拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，每種質(zhì)粒含量重復(fù)3次，計算變異系數(shù)。再以相同標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，在不同時間段進(jìn)行3次獨立重復(fù)試驗，以分析組間差異。

1.9 臨床樣品檢測對來自臨床采集的80份不明原因發(fā)熱患者的血標(biāo)本進(jìn)行核酸提取。用建立的TaqMan qPCR檢測方法和巢式PCR方法同時對該臨床患者血標(biāo)本核酸進(jìn)行檢測，計算2種檢測方法之間的符合率。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理質(zhì)粒構(gòu)建及測序結(jié)果分析采用Lasergene 7.0軟件。分別用SPSS 20.0 及GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析和作圖。兩種PCR方法陽性率比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建ompA基因經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增后，目的條帶大小為455 bp。將目的條帶插入到T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒并測序驗證。見圖1。

圖1 插入R.janponica(Anhui120株)ompA基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.2 TaqManqPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)化后的TaqMan qPCR最佳反應(yīng)體系是：PremixExTaq(Probe qPCR)10 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，探針(10 μmol/L)1.0 μl，模板2 μl，滅菌去離子水補(bǔ)足至20 μl體系。以各標(biāo)準(zhǔn)品中質(zhì)粒濃度的常用對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閥值為縱坐標(biāo)，獲得ompAqPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-3.220X+33.162，相關(guān)系數(shù)為0.996，擴(kuò)增效率為104.6%，表明建立的TaqMan qPCR方法具有良好的線性關(guān)系，見圖2。

圖2 ompA基因TaqMan qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 TaqMan qPCR的特異性分析建立的qPCR方法僅對斑點熱立克次體ompA有陽性擴(kuò)增信號，其他常見病原體包括普氏立克次體、恙蟲病東方體、無形體、埃里克體、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌均為陰性，表明建立的TaqMan qPCR方法特異性強(qiáng)，見圖3。

圖3 ompA基因TaqMan qPCR特異性結(jié)果

2.4 TaqMan qPCR的靈敏性分析建立的qPCR方法對質(zhì)粒含量為1.9×103、1.9×102、1.9×101、1.9×100和1.9×10-1拷貝有陽性擴(kuò)增信號，對1.9×100、1.9×10-1拷貝均未檢測到擴(kuò)增信號，表明本研究建立的方法的最低檢測限為19拷貝。見圖4。

圖4 ompA基因TaqMan qPCR敏感性結(jié)果 1～5：標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度為1.9×103、1.9×102、1.9×101、1.9×100和1.9×10-1拷貝

2.5 TaqMan qPCR的重復(fù)性分析建立的TaqManqPCR 檢測質(zhì)粒含量為1.9×106、1.9×105、1.9×104、1.9×103和1.9×102拷貝標(biāo)準(zhǔn)品的組間變異系數(shù)為0.56%～1.47%，組間變異系數(shù)為1.01%～2.29%，見表2。

表2 TaqMan 探針qPCR重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 TaqMan qPCR方法對臨床樣品檢測普通PCR陽性的樣品經(jīng)TaqMan qPCR的檢測方法檢測均為陽性，兩種檢測方法的一致率為91.25%。2種檢測方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.14，P<0.05)。

表明對80份臨床病人標(biāo)本核酸進(jìn)行檢測TaqManqPCR方法較巢式PCR敏感性更高。見表3。

表3 兩種PCR方法對臨床樣品的檢測結(jié)果

3 討論

國內(nèi)的斑點熱立克次體流行病學(xué)調(diào)查開始于1958年。長期的研究調(diào)查顯示斑點熱立克次體分布較廣，至今已有十幾個省市、自治縣證實存在斑點熱立克次體感染，從患者、蜱、蜱蟲卵以及嚙齒動物體內(nèi)共分離出20余株SFGR，流行病學(xué)調(diào)查顯示人群對該群病原體普遍易感[7, 13]。目前根據(jù)SFGR 17 ku抗原、gltA、geneD、ompA基因，已經(jīng)建立了多種PCR鑒定方法[14]。其中ompA作為斑點熱立克次體細(xì)胞膜表面蛋白，在立克次體的感染與免疫中發(fā)揮重要作用，如介導(dǎo)立克次體黏附和入侵宿主細(xì)胞、促進(jìn)立克次體在細(xì)胞內(nèi)生長繁殖以及誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答等[15]。

Regnery et al[16]根據(jù)立氏立克次體ompA基因設(shè)計的一對引物Rr190.70p(5-ATGGCGAAT ATTTCTCCAAAA-3′)和Rr190.602n(5′-AGTGCAG CATTCGCTCCCCCT-3′)，其擴(kuò)增序列結(jié)合限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性圖譜法(PCR/RFLP)被廣泛應(yīng)用于斑點熱立克次體新種的鑒定。此方法能區(qū)別具有高度遺傳同源性的SFGR，在于這對引物擴(kuò)增的目的片段既有SFGR的保守序列，又具有SFGR不同種之間特殊酶切位點，可以通過不同的限制性內(nèi)切酶消化區(qū)別SFGR不同的種。本實驗通過巢式PCR(兩對引物ompA-70F和ompA-701R、ompA-180F和ompA-602R)擴(kuò)增出SFGR的保守序列，再根據(jù)這段保守序列設(shè)計特異性的引物和探針，建立檢測斑點熱立克次體的TaqMan qPCR方法。

評估建立的qPCR方法的3項重要指標(biāo)包括：特異性、敏感性和重復(fù)性。本實驗在進(jìn)行特異性分析時，選擇斑疹傷寒立克次體、恙蟲病東方體、無形體，以及大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、螺旋體、支原體這7種病原體DNA與SFGR DNA同時進(jìn)行TaqMan qPCR檢測。前3種與SFGR屬于立克次體科下的不同種屬，后四種為臨床較為常見的病原體。結(jié)果顯示SFGR核酸擴(kuò)增有陽性信號，而其他7種均為陰性結(jié)果，顯示該方法具有較好的種屬特異性。對重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋檢測，最低可檢測出19拷貝，表明該方法具有良好的檢測靈敏度。對同一批次標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性分析時，兩者變異系數(shù)均低(最高僅為1.47%和2.29%)，結(jié)合構(gòu)建重組質(zhì)粒作為試驗的標(biāo)準(zhǔn)品可大量獲取以及長期保存的特點，可以有效保障后續(xù)開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化診斷試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的一致性。將建立的TaqMan qPCR方法與巢式PCR同時對臨床患者樣本進(jìn)行檢測，巢式PCR檢測有1份陽性，陽性率為1.25%，熒光定量PCR檢測有8份陽性，陽性率為10.00%，巢式PCR檢測陽性標(biāo)本用熒光定量PCR檢測為陽性，一致率為91.25%。兩種方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且熒光定量PCR檢測的靈敏度高于巢式PCR在檢測較低立克次體含量樣本時有一定的應(yīng)用價值。熒光定量PCR反應(yīng)時間短，一般45 min～1 h就能完成反應(yīng)有利于結(jié)果的快速輸出。因此本實驗建立的檢測斑點熱立克次體TaqMan qPCR方法可應(yīng)用于實驗室對疑似斑點熱患者樣本的快速診斷。