藏紅花素抑制AKT和STAT3的活化對黑色素瘤A375細胞裸鼠移植瘤生長、運動及多器官病變的影響

李 媛，李 娜，付文靜，舒春梅，張玉杰，馬 沖

黑色素瘤是一種由神經(jīng)嵴衍生的黑色素細胞引發(fā)的惡性上皮性腫瘤,多發(fā)于皮膚或黏膜，是最常見的皮膚致死性腫瘤之一[1]。黑色素瘤極具侵襲性，對常規(guī)放療和化療反應較差，導致患者預后不良[2]。雖然已開發(fā)出多種靶向藥物，但這些藥物對黑色素瘤患者的臨床療效改善有限[3]。因此，尋找新的有效的治療方法是提高患者生存率及降低發(fā)病率的重要方式。藏紅花素(crocin) 是從鳶尾科番紅花屬球根類草本植物藏紅花(CrocussativusI) 中提取的一種水溶性類胡蘿卜素。藏紅花素對人類腫瘤具有抗腫瘤活性、明顯抑制癌細胞的生長，但對正常細胞沒有影響[4]。該研究擬通過以黑色素瘤A375細胞裸鼠模型，探索藏紅花素對A375黑色素瘤生長、運動及對腫瘤引起的多器官病變是否存在AKT和STAT3信號通路的參與，以及該通路相關(guān)蛋白的表達情況，從而確定新的治療靶點，以期為藏紅花素應用于黑色素瘤的治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用45只SPF級健康成年雄性Sprague Dawleg(SD)小鼠，鼠齡為5～8個月，體質(zhì)量180～260 g，飼養(yǎng)于溫度23.5～25.6 ℃，相對濕度69%～84%的環(huán)境中，飼料與飲水自由攝取。

1.2 主要試劑與儀器藏紅花素(美國Sigma公司)；人源性黑色素瘤細胞系A375(中國科學院上海細胞生物學研究所)；10%胎牛血清、無血清細胞凍存(dulbecco modified eagle medium，DMEM) 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA) 蛋白定量試劑盒(美國PIERCE公司)；MatrigelTM底膜基質(zhì)(美國BD公司)。Ki-67、Capase-3、VEGE、Vimetin、E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin、AKT、p-AKT、STAT3和p-STAT3抗體(美國NEB公司)；HRP標記的山羊抗大鼠二抗(美國Santa Cruz公司)；Olympus BX51光學顯微鏡(日本奧林巴斯光學有限公司)；ABI StepOnePlus TM熒光定量PCR儀(美國基因儀器公司)。

1.3 皮下移植瘤模型建立將其中36只裸鼠用濃度為75^的酒精消毒皮膚，1 ml注射器吸取0.2 ml(2×106個細胞) A375細胞懸液接種至裸鼠右后肢的背部皮下，每注射2只裸鼠，充分混勻細胞懸液后繼續(xù)接種，接種完繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.4 實驗動物給藥劑量與分組建模后，將36只裸鼠隨機分為4組(每組9只)，分別為對照組(藏紅花素0 mg/kg)、藏紅花素低劑量組(藏紅花素20 mg/kg)、藏紅花素中劑量組(藏紅花素50 mg/kg)、藏紅花素高劑量組(藏紅花素100 mg/kg)。將對照組注射0.1 ml生理鹽水于腹腔, 隔日1次, 共7次；其余3組分別腹腔注射0.1ml濃度為20、50、100 mg/kg藏紅花素, 方法同對照組。剩余9只裸鼠作為健康對照組，用于HE染色。

1.5 實驗方法

1.5.1裸鼠移植瘤生長測定 接種7 d后，選擇造模成功的36只裸鼠，給藥28 d后各組裸鼠頸椎脫臼處死，剪開皮膚，小心剝離整個瘤塊，稱重、拍照后用4%多聚甲醛溶液固定，備用。

1.5.2免疫組化分析 采用鏈霉親和素-生物素-復合過氧化物酶試劑盒對腫瘤組織中Ki67、Caspase-3、VEGE、Vimetin進行免疫組織化學染色。最后，將載玻片沖洗、脫水并放置在顯微鏡下檢查和計數(shù)免疫反應細胞(黃色到棕色)。在與奧林巴斯顯微鏡相連接的Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)上對異種移植物的免疫染色進行分析。在400×放大倍數(shù)下，通過計算黃色到棕色細胞和5個隨機選擇的視野中的細胞總數(shù)來定量Ki67、Caspase-3、VEGE、Vimetin染色呈陽性的細胞。

1.5.3RT-PCR 用TRIzol試劑盒提取各組細胞總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，用PCR儀對cDNA進行擴增后用熒光定量試劑盒對進行定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參。反應條件為：95 ℃、反應15 s，總共40個循環(huán)，最后60 ℃反應30 s,70 ℃反應30 s。用于該反應的引物信息見表1。

表1 實時定量PCR目的基因的引物

1.5.4HE染色 取部分肝組織、肺組織和腎組織分別放入4%多聚甲醛溶液進行固定，24 h后脫水，石蠟包埋、切片；然后HE染色:將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ、100%、95%、90%、80%、70%的酒精各10 min，自來水沖洗；蘇木精染色、伊紅染色；由低到高濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；光學顯微鏡拍照，觀察其形態(tài)特征。

總之，數(shù)學教材是數(shù)學學習的重要根基，教師在理解教材時不能只注重例習題的研究，忽略對教材內(nèi)容知識的本質(zhì)及其與內(nèi)在聯(lián)系的深入理解。教師要博觀約取，又要見微知著；既要入乎其內(nèi)，又要出乎其外，教學時才能會讓學生真切地體驗到數(shù)學知識的“月暈而風，礎潤而雨”，進而才能使學生感受到真正的數(shù)學教育。

1.5.5免疫印跡法 使用裂解緩沖液裂解細胞樣品。然后，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Beyotime)定量蛋白質(zhì)濃度。含有20 mg蛋白質(zhì)的樣品在10% SDS-PAGE中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗(E-cadherin, 1 ∶1 000; N-cadherin, 1 ∶1 000; Fibronectin, 1 ∶1 000; AKT, 1 ∶1 000; p-AKT, 1 ∶1 000; STAT3, 1 ∶1 000；p-STAT3, 1 ∶1 000) 于4 ℃封閉過夜，第2天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL,設置曝光參數(shù)，檢測目的條帶對應化學發(fā)光強弱。

2 結(jié)果

2.1 藏紅花素對A375黑色素瘤體積和重量的影響與對照組比較，可明顯觀察到藏紅花低、中、高劑量組的黑色素瘤體積減小(圖1A)。與對照組比較，藏紅花低、中、高劑量組的黑色素瘤的重量均降低(F=73.84，P<0.05)(圖1B)。

2.2 藏紅花素對黑色素瘤生長的影響藏紅花素低、中、高劑量Ki67陽性細胞比率分別為(30.16±2.91)%、(18.67±2.07)%、(13.61±1.82)%， 較對照組(51.13±3.67)% 降低(P<0.05)。對照組可見極少量Caspase-3陽性細胞，藏紅花素低、中、高劑量組Caspase-3陽性細胞比率分別為(2.06±1.03)%、(5.24±1.23)%、(17.61±2.62)%，與對照組(0.87±0.23)%比較，均明顯增加(P<0.05)。見圖2。

圖3 不同組Bcl-2、Bax、Survivin mRNA的表達

2.3 藏紅花素對黑色素瘤A375細胞運動的影響藏紅花素低、中、高劑量組VEGF陽性細胞比率分別為(58.21±5.07)%、(24.91±2.13)% 、(18.31±1.82)% 較對照組(64.21±6.19)%降低(P<0.05)。藏紅花素低、中、高劑量組Vimentin陽性細胞比率分別為(47.21±4.07)%、(21.37±1.62)%、(6.34±1.03)% 較對照組(56.26±5.19)%降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 免疫組化檢測VEGF和Vimentin的表達 ×400

2.4 藏紅花素對黑色素瘤A375細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響與對照組比較，藏紅花素中、高劑量組E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(F=176.7，P<0.05)，N-cadherin蛋白表達水平降低(F=166.5，P<0.05)；同樣，與對照組比較，藏紅花素低、中、高劑量組Fibronectin蛋白表達水平降低(F=281.8，P<0.05)，見圖5。

圖5 E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin的蛋白表達

2.5 藏紅花素對A375黑色素瘤裸鼠各器官損傷的影響在健康對照組中肝、肺、腎組織結(jié)構(gòu)正常，肝組織中，對照組表現(xiàn)為大面積出血壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)受損，炎性細胞浸潤明顯；與對照組比較，藏紅花素低、中、高劑量組肝細胞壞死得以改善，浸潤性炎癥細胞數(shù)量減少，高劑量藏紅花(100 mg/kg)治療改善效果最好。肺組織中，對照組肺臟間質(zhì)嚴重水腫，肺泡內(nèi)出現(xiàn)大量炎性細胞和纖維素樣物質(zhì)沉積，組織局灶性壞死，肺泡壁明顯增厚，與對照組比較，藏紅花素低、中、高劑量組肺泡內(nèi)炎性細胞減少，間質(zhì)水腫減輕，治療改善效果隨藏紅花素劑量增加而增加。腎組織中，對照組腎小管萎縮，管腔擴張，間質(zhì)區(qū)域的炎性細胞浸潤和纖維化。與對照組比較，藏紅花素低、中、高劑量組腎損傷情況得以改善，腎小管萎縮減輕，管腔回收，間質(zhì)區(qū)域的炎性細胞浸潤和纖維化程度減輕。見圖6。

圖6 不同組各器官組織病理學變化 HE染色×400

2.6 藏紅花素對AKT和STAT3磷酸化水平的影響與對照組比較，藏紅花素中、高劑量組AKT的磷酸化水平降低(F=276.4，P<0.05)，STAT3的磷酸化水平降低(F=327.2，P<0.05)。見圖7。

圖7 不同組AKT、STAT3蛋白磷酸化水平

3 討論

黑色素瘤是一種極具侵襲性的癌癥，對大多數(shù)傳統(tǒng)治療都有抵抗能力。盡管目前治療黑色素瘤的方法眾多，但其預后仍然很差，5年生存率低于5%[5]。由于反應率低且毒性顯著，大多數(shù)常規(guī)化療藥物在黑色素瘤治療中都失敗了。近年來，針對相關(guān)基因或通路的靶向治療明顯提高了黑色素瘤患者的生存率[6]，目前研究相對較多的主要是針對BARF、MEK和cKIT的靶向藥物，但由于靶向選擇的局限性，只對某一部位或者某一類型黑色素瘤有效，選擇性太大，以及對靶向藥物的原發(fā)性或者繼發(fā)性耐藥仍然是棘手的問題[7]。因此，迫切需要尋找新的有效、安全的黑色素瘤治療方法。

藏紅花素具有抗癌活性，通過抑制細胞生長和誘導細胞死亡來抑制腫瘤的生長。研究[8]表明增殖標志物Ki-67在黑色素瘤垂直生長期明顯升高，Survivin表達的上調(diào)對黑色素瘤細胞的凋亡具有抵抗作用，藏紅花素長期治療能夠殺死癌細胞。Wang et al[9]報道稱藏紅花素可增加Bcl-2/Bax比率，上調(diào)Caspase-3誘導皮膚癌細胞凋亡。與前人研究結(jié)果一致，本研究顯示用藏紅花素治療后，黑色素瘤體積減小，重量減輕，黑色素瘤A375細胞中Ki67陽性細胞數(shù)減少，Caspase-3陽性細胞增加，并且下調(diào)了Bcl-2/Bax和Survivin mRNA的表達。因此，這表明藏紅花素能夠抑制黑色素瘤的生長。

黑色素瘤是一種具有高度轉(zhuǎn)移和侵襲性特點的腫瘤。研究[10]發(fā)現(xiàn)藏紅花素抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞中VEGF的表達。Festuccia et al[11]報道稱藏紅花素使前列腺癌細胞中Vimentin蛋白表達明顯降低。與前人研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素處理的黑色素瘤A375細胞中VEGF和 Vimentin的表達水平明顯降低。這表明藏紅花素可抑制黑色素瘤A375細胞的侵襲與遷移。

發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的黑色素瘤細胞失去上皮表型，獲得更多間充質(zhì)細胞樣特征，細胞間黏附減少，細胞獲得侵襲潛能。研究[12]表明黃芩苷可以降低E-cadherin表達，增加N-cadherin的表達，從而抑制A375細胞EMT的活化。Novak et al[13]證實了黑色素瘤細胞系中Fibronectin的異常表達模式，A375細胞中Fibronectin蛋白表達水平明顯高于正常黑色素細胞。與前人研究結(jié)果一致，本研究顯示藏紅花素使黑色素瘤A375細胞E-cadherin蛋白表達明顯升高，N-cadherin和Fibronectin蛋白表達明顯降低。表明藏紅花素可通過抑制EMT相關(guān)蛋白的表達，從而抑制黑色素瘤A375細胞的侵襲和遷移。

通過對肝臟、肺臟、腎臟的組織學染色，評估藏紅花素對A375黑色素瘤裸鼠各器官損傷的影響。研究顯示藏紅花素對大鼠腎損傷具有保護作用，藏紅花素能減少HS誘導的肺損傷[14]。而由于藏紅花素具有較強的抗氧化性能，使用藏紅花素治療可消除丙烯酰胺誘導的肝損傷[15]。本研究表明藏紅花素減緩了A375黑色素瘤裸鼠肝臟、肺臟、腎臟的損傷，與前人研究結(jié)果一致，表明藏紅花素對黑色素瘤A375細胞引起的器官損傷具有一定的治療作用。

AKT和STAT3信號通路在黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究[12]顯示，黃芩苷可以降低A375細胞中p-AKT和p-mTOR的水平。Kim et al[10]使用藏紅花素治療多發(fā)性骨髓瘤以劑量和時間依賴的方式降低了STAT3的磷酸化。本研究顯示藏紅花素明顯降低AKT和STAT3的磷酸化水平。因此，藏紅花素抑制AKT和STAT3的活性，表明藏紅花素可抑制黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展。