環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者全血中的表達(dá)和意義

羅 清，黃自坤，張 露，李俊明

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種病因不明的，常見的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡期婦女[1]。目前SLE的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，診斷標(biāo)準(zhǔn)由美國風(fēng)濕病協(xié)會制定，符合11條中的4條即可診斷[2]。用于診斷的實驗室指標(biāo)主要為抗核抗體、抗雙鏈DNA、抗Sm等，但是這些自身抗體敏感性或特異性較低，患者中陽性率也較低，有一定的誤診和漏診[3]。環(huán)狀RNA(circular RNAs, circRNAs)是最近新發(fā)現(xiàn)的區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類特殊RNA，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)[4]。此外，circRNA具有疾病和組織特異性，這使得circRNA在作為新型臨床生物標(biāo)記物的開發(fā)應(yīng)用上具有明顯優(yōu)勢。研究[5-6]顯示circRNA可用于多種疾病的診斷、鑒別診斷、預(yù)后監(jiān)測。在SLE中的作用也逐漸得到大家的認(rèn)識[7]。該研究首次以全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715為研究目標(biāo)，探討其在SLE中臨床意義以及診斷和鑒別診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年9月～2019年2月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科76例SLE患者，其中男6例，女70例；年齡10～66(40.2±16.4)歲，臨床診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1997年修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)[2]，并排除嚴(yán)重糖尿病、高血壓、高血脂、心腦血管疾病、肝腎疾病、血栓性疾病、血小板疾病等其他疾病。正常對照組33例，均為健康志愿者，排除炎癥或其他自身免疫性疾病，其中男4例，女29例；年齡19～84(42.5±13.3)歲。2組性別、年齡無顯著性差異。詳細(xì)收集SLE患者臨床資料及相關(guān)實驗室檢查數(shù)據(jù)，并計算其SLE疾病活動指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)。此外，選取同期收治的56例初診未治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和32例初診未治療的強直性脊柱炎作為非SLE疾病對照組，其中男34例，女54例；年齡13～84(43.1±14.4)歲。臨床診斷分別符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1987年修訂類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]和美國風(fēng)濕性學(xué)會強直性脊柱炎修訂標(biāo)準(zhǔn)[9],并排除其他疾病。本實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者和健康人均簽署知情同意書。

1.2 SLE治療入選的76例SLE患者中47例為初診未治療者，其中7例初診未治療者于治療前和治療半個月后收集其空腹EDTA抗凝外周血用于PCR檢測。初診未治和復(fù)診SLE患者均根據(jù)病情嚴(yán)重程度選取治療方案：① 病情穩(wěn)定(SLEDAI為0～4分)者維持治療；② 病情輕度活動(SLEDAI為5～9分)者用潑尼松或糖皮質(zhì)激素+羥氯喹/甲氨蝶呤/來氟米特治療；③ 病情中度活動(SLEDAI為10～14分)者用糖皮質(zhì)激素+環(huán)磷酰胺/霉酚酸酯治療；④ 病情重度活動(SLEDAI≥15分)者先用糖皮質(zhì)激素沖擊加環(huán)磷酰胺，再按病情中度活動治療方案治療。

1.3 試劑和主要儀器TRIzol 試劑購自Invitrogen公司；PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR ? Premix Ex Taq TM購自大連寶生物 TaKaRa公司；抗雙鏈DNA抗體檢測試劑盒購自上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司；抗可提取核抗原抗體檢測試劑盒購自德國歐盟公司；hsa_circ_0002715及內(nèi)參基因β-actin引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000 紫外分光光度計購自美國Nanodrop公司；Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀器購自美國ABI公司；特定蛋白儀IMMAGE800購自美國Beckman Coulter公司；動態(tài)血沉儀購自北京普利生公司；血常規(guī)檢測儀購自日本希森美康。

1.4 全血總RNA提取采集受試者清晨空腹EDTA抗凝外周血2 ml，6 h內(nèi)送檢，取250 ml全血加用750 ml TRIzol試劑處理，放-80 ℃冰箱保存。按TRIzol試劑說明書分別提取SLE患者、非SLE患者和健康對照者全血的總RNA，焦碳酸二乙酯處理過的蒸餾水溶解RNA，采用RNA純化試劑盒純化總RNA。進(jìn)一步使用Nanodrop ND-1000紫外分光光度計對總RNA進(jìn)行定量和質(zhì)量分析。

1.5 RT-PCR檢測采用RT-PCR SYBR Green法，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行hsa_circ_0002715的檢測。提取PBMC總RNA，DEPC水溶解后，取1 μl RNA，利用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，PCR引物序列見表1。反應(yīng)體系包括：1 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.5 μmol/L上游引物、0.5 μmol/L下游引物、1×SYBR熒光染料試劑。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，72 ℃、30 s，40個擴(kuò)增循環(huán)。所有樣品做3個復(fù)孔。RT-PCR使用ABI7500儀器進(jìn)行。分析待測標(biāo)本的擴(kuò)增熔解曲線，均為單峰，無非特異性擴(kuò)增。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，采用相對定量法對RT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析，計算2-ΔΔCt。引物序列見表1。

表1 熒光定量 PCR 引物序列

1.6 SLE的其他指標(biāo)檢測方法免疫球蛋白G、補體3、補體4、C-反應(yīng)蛋白采用速率散色比濁法，抗雙鏈DNA抗體采用酶聯(lián)免疫吸附法，抗可提取核抗原抗體采用免疫印記法檢測，血沉采用動態(tài)血沉儀法，血常規(guī)采用電阻抗法。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)，2組樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，否則采用非參數(shù)檢驗。多組間非參數(shù)檢驗用于3組之間的比較，同時Dunn′s post-hoc test用于多組間非參數(shù)檢驗后的兩兩比較。2個變量之間相關(guān)性采用spearman相關(guān)分析。受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析評價circRNA診斷和鑒別診斷的敏感性和特異性。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715在SLE患者中表達(dá)的水平結(jié)果如圖1A所示，采用多組間非參數(shù)檢驗分析表明SLE患者、非SLE患者和健康對照者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；此外本文采用Dunn′s post-hoc test將檢驗效能調(diào)整后，再分析3組中兩兩組間比較顯示，SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平高于對照者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平高于非SLE患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；但并未發(fā)現(xiàn)非SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平高于對照者，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715在健康對照者、非SLE患者、SLE患者中的表達(dá)水平

2.2 全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平與SLE患者臨床參數(shù)的關(guān)系本文分析了全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平與SLE患者疾病活動性評分、補體3、補體4、免疫球蛋白G、自身抗體(抗雙鏈DNA抗體、抗核小體抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗Sm抗體、抗nRNP/Sm抗體、抗核糖體蛋白P抗體)、血沉、C-反應(yīng)蛋白、狼瘡腎、血液系統(tǒng)損傷(白細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白、紅細(xì)胞比積、血小板數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量、單核細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量)、皮疹、關(guān)節(jié)炎、脫發(fā)、漿膜炎、治療等臨床參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果如圖2所示，SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平與補體3(rs=-0.453，P<0.001)，補體4(rs=-0.336，P=0.004)呈負(fù)相關(guān)，與抗雙鏈DNA抗體(rs=0.253，P=0.040)呈正相關(guān)，抗核小體抗體陽性的SLE患者其全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平高于抗核小體抗體陰性者(P<0.001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，本研究還顯示SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平SLE患者的白細(xì)胞數(shù)量(rs=-0.486，P<0.001)、紅細(xì)胞數(shù)量(rs=-0.297，P=0.009)、血紅蛋白(rs=-0.277，P<0.016)、紅細(xì)胞比積(rs=-0.303，P=0.008)、血小板數(shù)量(rs=-0.300，P=0.009)呈負(fù)相關(guān)；但并未發(fā)現(xiàn)其與疾病活動性評分、狼瘡腎等臨床表現(xiàn)以及治療有關(guān)。

2.3 全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715對SLE診斷的價值為評估全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715對SLE的診斷價值，對SLE患者和健康對照者的全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平進(jìn)行ROC分析，結(jié)果如圖3A所示，ROC曲線下面積AUC為0.772(95%CI:0.683～0.861;P<0.001)，Cut-off值為1.939，敏感性為63.16%，特異性為81.82%，陽性預(yù)測值為88.89%，陰性預(yù)測值為49.09%，約登指數(shù)為0.450。

為評估全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715對SLE的鑒別診斷價值，對SLE患者與非SLE患者中全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715的表達(dá)水平進(jìn)行ROC分析，結(jié)果如圖3B所示，ROC曲線下面積AUC為0.674(95%CI:0.591～0.757;P<0.001)，Cut-off值為2.612，敏感性為55.26%，特異性為72.73%，陽性預(yù)測值為63.64%，陰性預(yù)測值為65.31%，約登指數(shù)為0.280；對SLE與所有對照者(非SLE患者+健康對照者)中全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715的表達(dá)水平進(jìn)行ROC分析，結(jié)果如圖3C所示，ROC曲線下面積AUC為0.701(95%CI:0.624～0.777;P<0.001)，Cut-off值為3.063，敏感性為51.32%，特異性為80.17%，陽性預(yù)測值為61.90%，陰性預(yù)測值為72.39%，約登指數(shù)為0.315。

2.4 全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715、anti-dsDNA、聯(lián)合環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA對SLE診斷價值的比較本研究前面結(jié)果表明環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715對SLE診斷Cut-off值分別為>1.939(SLE患者vs健康對照者), >2.612(SLE患者vs非SLE患者)，>3.063(SLE患者vs非SLE患者+健康對照者)。76例SLE患者中有66例患者收集空腹EDTA抗凝外周血檢測環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715時進(jìn)行了anti-dsDNA檢測，因此分別根據(jù)上述ROC曲線獲得的Cut-off值和anti-dsDNA是否為陽性來分析三個隊列(SLE患者vs健康對照者；SLE患者vs非SLE患者；SLE患者vs非SLE患者+健康對照者)中環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715、anti-dsDNA、聯(lián)合環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA對SLE診斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，結(jié)果如表2所示，環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715的敏感性均高于anti-dsDNA，且聯(lián)合環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA的敏感性和特異性均最高。

圖2 全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平與SLE患者臨床參數(shù)的關(guān)系

表2 環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715、anti-dsDNA、聯(lián)合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA對SLE的診斷價值

3 討論

研究[10]表明circRNAs在血液中可長期穩(wěn)定存在，RNA酶降解作用、煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境、長期保存等各種處理方法均不會造成血液circRNAs的損失，比較適宜作為基本的臨床診斷標(biāo)志物。近期，國內(nèi)外均有學(xué)者嘗試探討circRNAs作為SLE診斷標(biāo)志物的可行性，并取得了可喜的成果，如Li et al[11]發(fā)現(xiàn)外周血hsa_circ_0057762和hsa_circ_0003090在兒童SLE中特異性高表達(dá)，且hsa_circ_0057762表達(dá)水平與SLE患者的疾病活動性評分呈正相關(guān)，進(jìn)一步ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0057762和hsa_circ_0003090的AUC均大于0.8，因此hsa_circ_0057762和hsa_circ_0003090可作為兒童SLE的一種潛在的新型分子標(biāo)志物；Miao et al[12]研究發(fā)現(xiàn)外周血單個核細(xì)胞中circPTPN22可作為SLE診斷的標(biāo)志物，且其含量與SLE患者的疾病活動性和嚴(yán)重程度密切相關(guān)；此外，Ouyang et al[13]發(fā)現(xiàn)血漿circRNA_002453在狼瘡腎中明顯上調(diào)，并且其含量與24 h蛋白尿和SLE腎損的活動性評分呈正相關(guān)，可作為狼瘡腎診斷及嚴(yán)重程度評估的一種潛在的新型分子標(biāo)志物。

圖3 SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715的受試者工作曲線分析

環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715位于21號染色體，即21號染色體47801608-47805898(正鏈)，被 RNA 轉(zhuǎn)錄酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄本有299 nt。本課題組之前研究采用芯片檢測SLE患者全血環(huán)狀RNA表達(dá)譜顯示環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715明顯上調(diào)。目前尚未見有關(guān)環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715的研究報道。為了研究環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715在SLE中的表達(dá)水平及其臨床意義，本研究采用qRT-PCR檢測76例SLE患者和33例健康對照者全血中環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 進(jìn)一步分析SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)的臨床意義顯示，SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平與SLE患者監(jiān)測疾病活動的常用指標(biāo)補體[1]水平呈負(fù)相關(guān)；且SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平與anti-dsDNA、anti-nuclesome含量相關(guān)，而anti-dsDNA、anti-nuclesome也是目前臨床上常用的監(jiān)測SLE患者疾病活動性指標(biāo)和SLE診斷指標(biāo)[1,14]；此外，本研究還顯示環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715與SLE患者血液系統(tǒng)受累(WBC減少、RBC減少、PLT減少、貧血)情況相關(guān)。這些結(jié)果表明環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平與疾病活動性和血液系統(tǒng)受累嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，即患者疾病越嚴(yán)重，hsa_circ_104871分子的表達(dá)水平越高。

本研究采用ROC曲線分析環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715的診斷價值發(fā)現(xiàn)，SLE患者環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715的AUC為0.772(95%CI:0.683～0.861;P<0.001)，Cut-off值為1.939，敏感性為63.16%，特異性為81.82%，可有效地從HC中診斷出SLE患者。另外，SLE可累及關(guān)節(jié)，患者經(jīng)常會有關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，臨床上容易與RA和AS等其他自身免疫性疾病混淆，為此本研究比較了SLE患者與non-SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，SLE患者環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達(dá)水平顯著高于non-SLE患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步的ROC曲線分析證實其可有效將SLE患者與non-SLE患者區(qū)別開來，可用于SLE的鑒別診斷。此外，anti-dsDNA是公認(rèn)的SLE診斷指標(biāo)，但其診斷敏感性較低，為40%～50%[15]，且有研究[15]顯示anti-dsDNA聯(lián)合其他SLE診斷指標(biāo)可明顯提高其診斷敏感性和特異性。本研究比較hsa_circ_0002715，anti-dsDNA，聯(lián)合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA的診斷效能顯示，hsa_circ_0002715對SLE的診斷敏感性要高于anti-dsDNA，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而聯(lián)合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA對SLE的診斷敏感性和特異性均提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715，尤其是聯(lián)合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA是可用于SLE患者的診斷以及鑒別診斷。

綜上，SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715的表達(dá)明顯上調(diào)，且與疾病活動性和血液系統(tǒng)受累的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可作為SLE的潛在診斷及鑒別診斷標(biāo)志物。相信隨著研究的深入和檢測技術(shù)的提高，CircRNAs有望成為SLE乃至其他自身免疫性疾病新的血液標(biāo)志物，改變和補充傳統(tǒng)SLE實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)。