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    鄭州市23例SARS-CoV-2核酸單靶標陽性標本的跟蹤檢測分析

    2020-08-05 07:04:20牛衛(wèi)東許太彬孫麗梅趙瑞臻
    檢驗醫(yī)學 2020年7期
    關(guān)鍵詞:陽性者靶標核酸

    牛衛(wèi)東,許太彬,孫麗梅,安 戈,史 軍,李 羿,趙瑞臻

    (鄭州市疾病預防控制中心,河南 鄭州 450007)

    2019年12月,武漢市出現(xiàn)了由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)[1]。SARS-CoV-2是一種β屬冠狀病毒,屬于單鏈RNA病毒,有包膜[2],其 基因特征與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome-related coronavirus,SARSr-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(middle east respiratory syndrome-related coronavirus,MERSr-CoV)有明顯區(qū)別[3-4]。目前,實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)仍是COVID-19疑似病例的主要確診方法[5]。實時熒光RT-PCR主要檢測SARS-CoV-2基因組中開放讀碼框1ab(open reading frame 1ab,ORF1ab)和核殼蛋白(nucleocapsid protein,N)[5]。在SARSCoV-2核酸檢測過程中會出現(xiàn)核酸單靶標陽性的情況,雖然在最新版《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》[5]中明確了SARS-CoV-2核酸單靶標陽性的判定規(guī)則,但仍需對SARS-CoV-2核酸單靶標陽性的情況進行分析和探討。截至2020年3月11日,鄭州市疾病預防控制中心實驗室針對全市COVID-19疑似患者和密切接觸者共做了4 375次的SARS-CoV-2核酸檢測,其中有23例COVID-19疑似患者和密切接觸者首次檢測(以下簡稱首檢)出現(xiàn)了SARS-CoV-2核酸單靶標陽性的情況,本研究擬對這23例標本進行跟蹤檢測,以期為實驗室檢測提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 標本來源

    收集2020年1月20日—3月11日,鄭州市COVID-19疑似患者、密切接觸者的鼻拭子或咽拭子標本。所有標本均嚴格按照《新型冠狀病毒肺炎防控方案》采集并轉(zhuǎn)運至鄭州市疾病預防控制中心微生物檢驗所病毒實驗室。

    1.2 試劑與儀器

    病毒核酸提取試劑盒(EX-RNA/DNA病毒)和GeneRoteX 96全自動核酸提取儀均購自西安天隆科技有限公司。Heidolph-Multi Reax多位試管振蕩器購自德國海道夫公司。Parafilm封口膜購自美國BEMIS公司。采用實時熒光RTPCR檢測SARS-CoV-2,試劑盒購自上海伯杰醫(yī)療科技有限公司,檢測儀器為CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

    1.3 標本的處理與檢測

    將鼻拭子/咽拭子病毒采樣管用封口膜密封后,置于試管振蕩器上,振蕩10 min。按照SARS-CoV-2核酸提取試劑盒說明書要求完成核酸提取,吸取5 μL標本,加入到20 μL分裝好的核酸檢測液中,將剩余標本置于-20 ℃保存。

    實時熒光RT-PCR反應條件為:逆轉(zhuǎn)錄50 ℃10 min,預變性95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,55 ℃40 s,45個循環(huán)。ORF1ab基因檢測通道為FAM,N基因為HEX/VIC,內(nèi)參基因為ROX。

    1.4 結(jié)果評價

    1.4.1 質(zhì)控標準 在同一檢測中必須同時滿足:陽性對照3個通道擴增循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)均≤30,陰性對照均無Ct值,否則本次檢測無效。

    1.4.2 結(jié)果判讀 若ROX通道Ct值>38,則判定標本不合格。若ROX通道Ct值≤38,F(xiàn)AM通道、HEX/VIC通道均無Ct值,則判定為陰性。FAM通道、HEX/VIC通道Ct值≤38,則判定為陽性。FAM通道、HEX/VIC通道均有Ct值,且有Ct值>38,或僅有單個通道出現(xiàn)明顯擴增曲線時,判定為不確定,建議復測。本研究以僅單個通道出現(xiàn)明顯擴增曲線作為單靶標陽性。對單靶標陽性的標本,重新采樣檢測間隔時間不少于24 h。

    1.5 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示,組間比較采用χ2檢驗;如果<5的預期值>總數(shù)的1/5,且樣本數(shù)<40,則用Fisher精確概率法進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 檢測概況

    對23例首檢為SARS-CoV-2核酸單靶標陽性者重新采樣檢測,其中有8例(34.78%)SARSCoV-2核酸為陽性,15例(65.22%)為陰性。見表1。

    2.2 重新采樣檢測陽性率

    在23例首檢為SARS-CoV-2核酸單靶標陽性的標本中,有6例為ORF1ab基因單靶標陽性,占26.09%,其中有1例重新采樣檢測后被確認為陽性,重新采樣檢測陽性率為16.67%;有17例為N基因單靶標陽性,占73.91%,其中有7例重新采樣檢測后被確認為陽性,重新采樣檢測陽性率為41.18%。2個基因之間重新采樣檢測陽性率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.174,P>0.05)。見表2。

    2.3 檢測次數(shù)

    從整體來看,23例COVID-19疑似患者和密切接觸者中,有16例進行了2次采樣檢測,6例進行了3次采樣檢測,1例進行了5次采樣檢測,方得到最終可判定的結(jié)果。從基因型別來看,6例ORF1ab基因單靶標陽性者均進行了2次采樣檢測,方得到最終可判定結(jié)果;17例N基因單靶標陽性者中,10例進行2次采樣檢測,6例進行3次采樣檢測,1例進行了5次采樣檢測,方得到最終可判定的結(jié)果。從最終確診情況來看,8例確認為SARS -CoV-2核酸陽性的患者中,7例進行了2次采樣檢測,1例進行了3次采樣檢測;15例SARS-CoV-2核酸陰性者中,9例進行了2次采樣檢測,5例進行了3次采樣檢測,1例進行了5次采樣檢測。如果按最新版檢測方案[5]判定,將會產(chǎn)生6例假陽性結(jié)果,6例均為N基因單靶標陽性。見表2。

    表1 23例SARS-CoV-2核酸單靶標陽性者跟蹤檢測Ct值結(jié)果

    2.4 Ct值分布

    首檢單靶標陽性標本整體的C t值為36.00~36.99時出現(xiàn)高峰,首檢ORF1ab基因單靶標陽性的Ct值集中分布于36.00~38.00。首檢單靶標陽性轉(zhuǎn)陽標本的Ct值分布比較分散。有1例Ct值為40.68的標本在第2次檢測后被確認為陽性。見圖1。

    表2 得到最終可判定的結(jié)果所用檢測次數(shù) 例

    圖1 SARS-CoV-2核酸單靶標陽性標本Ct值分布

    3 討論

    自2019年12月COVID-19疫情在武漢暴發(fā)以來,涌現(xiàn)出了各種針對SARS-CoV-2的檢測方法,但實時熒光RT-PCR仍是COVID-19的主要確診方法[5]。按照相關(guān)試劑盒說明書要求,單靶標陽性標本應該判定為不確定。本研究對23例首檢單靶標陽性標本的跟蹤檢測結(jié)果顯示,有34.78%的單靶標陽性標本在跟蹤檢測中被確認為陽性。提示單靶標陽性標本應該進行跟蹤檢測,以免造成假陰性結(jié)果,增加疫情擴散風險。

    COVID-19疫情突然暴發(fā),臨床檢測需求增加,但很多檢測試劑的靈敏度、穩(wěn)定性和可靠性還有待進一步驗證[6],有些試劑ORF1ab基因和N基因的檢測靈敏度之間有差異,可能會出現(xiàn)單靶標陽性結(jié)果[7]。還有研究結(jié)果顯示,實時熒光定量PCR檢測N基因的靈敏度更高[8]。有研究結(jié)果顯示,COVID-19潛伏期長達14 d,在感染早期臨床表現(xiàn)不典型[9],病毒復制數(shù)量達不到試劑盒檢測閾值時,可能會出現(xiàn)假陰性或單靶標陽性[10]。

    假陰性和單靶標陽性結(jié)果的出現(xiàn)也可能與標本采集質(zhì)量有關(guān)[10],大量非呼吸專業(yè)醫(yī)護人員不熟悉鼻/咽拭子的采集規(guī)范,可能會造成采集部位不準確[10]、采集手法不到位等情況,影響采集標本的質(zhì)量。還有研究表明,痰液的檢出率明顯高于鼻/咽拭子,說明多種標本同時采集可以提高新冠病毒檢出率[11]。

    ORF1ab基因中序列同一性在SARS-CoV-2和乙型冠狀病毒其他成員之間<90%,是區(qū)分SARS-CoV-2與其他冠狀病毒的重要靶標[4],ORF1ab基因特異性強,因此23例單靶標陽性標本中,僅有6例為ORF1ab基因單靶標陽性。

    在冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中,N蛋白是最保守和最穩(wěn)定的蛋白,因此N基因相對保守[4,12],易與其他發(fā)生交叉反應,因此一些試劑檢測N基因的靈敏度更高[8]。23例單靶陽性標本中,73.91%為N基因單靶標陽性,且有10例轉(zhuǎn)為陰性,可能是與其他病毒發(fā)生交叉反應。N基因單靶標陽性標本中有7例轉(zhuǎn)為陽性,重新采樣檢測陽性率為41.18%。

    從整體的檢測次數(shù)來看,絕大多數(shù)首檢單靶標陽性者在連續(xù)2次跟蹤檢測后,就能夠得到明確結(jié)果,但仍有部分單靶標陽性者需要檢測3~5次。多次檢測后,N基因仍出現(xiàn)單靶標陽性者也可能是其他冠狀病毒感染[13]。按照《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》中實驗室確認陽性標本的標準,23例單靶標陽性的標本中將出現(xiàn)6例假陽性標本,且6例假陽性標本均為N基因單靶標陽性,提示同種類型標本2次采樣檢測中均出現(xiàn)單靶標陽性的檢測結(jié)果時,應該慎重對待,并重新采樣跟蹤檢測。

    從重新采樣檢測陽性標本的Ct值分布來看,有1例Ct值為40.68的首檢單靶標陽性標本在第2次檢測時被確認為陽性,提示單靶標陽性標本的Ct值不論是高是低均應重新采樣檢測。

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