高齡女性卵泡液中差異表達蛋白質篩選及其生物信息學分析

孫金龍，郭瓊，相珊，趙帥，連方

1 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南250011；2 山東省婦幼保健院；3 山東中醫(yī)藥大學

年齡是女性卵巢功能的決定性因素[1]，而卵巢功能減退是高齡女性面臨的一個重要不孕因素。目前，臨床上許多要求生育的高齡女性與晚婚晚育、高齡失獨等有關。因此，明確高齡女性卵巢功能衰退的生物學基礎，具有重要的現(xiàn)實意義。卵巢功能衰退不是單一、獨立的事件，與人體衰老一樣，也是多系統(tǒng)、多途徑、多環(huán)節(jié)的整體變化[2，3]，而蛋白質組學研究最能體現(xiàn)這種整體性。本研究通過蛋白質組學篩選高齡婦女卵泡液差異表達蛋白質并對其進行生物信息分析，以探討女性隨年齡增大卵巢功能衰退的生物學基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，選取2017年12月～2018年12月于我院擬行輔助生殖技術助孕的女性患者。納入標準：①年齡21～42歲；②因男方精子數(shù)量和活力不足而導致女性不孕；③簽署相關的知情同意書。排除標準：①卵巢早衰；②合并子宮內膜異位癥、子宮腺肌病、卵巢腫瘤、多囊卵巢綜合征、盆腔炎性疾病等；③合并影響卵巢功能的其他系統(tǒng)疾病。共收集女性不孕患者100例，根據(jù)年齡將其分為高齡組(年齡≥35歲)和非高齡組(年齡﹤35歲)各50例。高齡組年齡(37.48±2.08)歲，啟動日血清人抗繆勒管激素(AMH)水平(3.37±1.46)ng/mL，雙側卵巢竇卵泡數(shù)(8.70±2.31)個；非高齡組年齡(29.22±2.84)歲，血清AMH水平(7.55±2.73)ng/mL，雙側卵巢竇卵泡數(shù)(12.68±3.62)個。高齡組年齡高于非高齡組，而血清AMH、雙側卵巢竇卵泡數(shù)均低于非高齡組(P均<0.05)。

1.2 IVF與卵泡液的獲取 兩組均給予促性腺激素釋放激素(GnRH)拮抗劑方案進行促排卵，以基因重組人促卵泡激素150～250 U啟動，啟動第5天使用GnRH拮抗劑0.25 μg/d直至扳機日，促卵泡激素用藥時間11～14 d；在主導卵泡群直徑達1.8～2.0 cm時，常規(guī)取卵并收集卵泡液；將卵泡液以3 000 r/min離心l0 min，吸取上清部分置入EP管并編號，-80 ℃冰箱內凍存。

1.3 卵泡液中差異表達蛋白質篩選與鑒定 采用液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)。復蘇卵泡液，4 ℃下以12 000 r/min離心提取蛋白質，并以BCA法測定其濃度。吸取一部分蛋白質溶液，用50 mmol/L碳酸氫銨及DTT調整終濃度為10 mmol/L，再以碘乙酰胺調整終濃度為50 mmol/L，常溫反應30 min，避光。將溶液以超濾管高速離心后，再次用50 mmol/L碳酸氫銨清洗；繼續(xù)使用胰蛋白酶酶解，酶解產(chǎn)物經(jīng)50 mmol/L碳酸氫銨清洗，然后經(jīng)TFA酸化、除鹽等程序后獲得蛋白質懸液。使用冷凍干燥儀凍干蛋白質懸液，準備LC-MS/MS檢測。LC-MS/MS檢測：液相采用90 min梯度，流速為220 nL/min，預柱用AcclaimR PepMap100 column，分析柱用AcclaimR PepMap RSLC column。使用Xcalibur2.2 SP1軟件采集質譜數(shù)據(jù)，以蛋白質豐度比>1.67(上調)以及<0.6(下調)為標準篩選差異表達蛋白質。通過蛋白質譜搜庫軟件Proteome Discoverer搜索UniProt數(shù)據(jù)庫，檢索后形成原始raw文件。使用Maxquant1.4.0.8軟件對raw文件在uniprot_proteomes-human.fasta數(shù)據(jù)庫內進行差異表達蛋白質鑒定。

1.4 卵泡液中差異表達蛋白質的生物信息學分析 通過DAVID在線分析軟件(https://david-d.ncifcrf.gov/)進行差異表達蛋白質的基因本體論(GO)和京都基因百科全書(KEGG)富集分析，并導出分析結果。GO富集分析差異表達蛋白質的生物進程、生物學功能、細胞組分，KEEG富集分析差異表達蛋白質的相關信號通路。

2 結果

2.1 差異表達蛋白質篩選結果 與非高齡組比較，高齡組卵泡液中共篩選獲得23個差異表達蛋白質，其中上調9個、下調14個。見表1。

表1 差異表達蛋白質名稱及其表達變化

2.2 差異表達蛋白質GO富集分析結果 在生物進程方面，差異表達蛋白質涉及受體介導的內吞作用、補體激活、內肽酶活性的負調控、參與吞噬作用的Fcγ受體信號通路、免疫應答調節(jié)等。在生物學功能方面，差異表達蛋白質的主要功能包括細胞分化、增殖、凋亡(RBP4、TIMP1、IGFBP3、TNFRSF1A、IGFBP6、HGFAC、POLE、GTF3C1、TGFβI、IGFBP7、CCDC112、SYCP2、TRAF6)以及免疫(C1R、IGHG4、Igλ5鏈I區(qū)、FCGR3A、C4A、CST3)、脂代謝(RBP4、APOB、PLTP、AZGP1)、糖代謝(RBP4、AZGP1)、凝血(F13B)等，尤其以細胞凋亡與增殖調控方面更為明顯。在細胞組分方面方面，差異表達蛋白質主要在胞外區(qū)、胞外體、胞外空間、內吞囊腔等發(fā)揮作用。

2.3 差異表達蛋白質KEGG通路富集分析結果 KEGG分析顯示，差異表達蛋白質富集于PPAR、補體和凝血級聯(lián)、吞噬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等信號通路。

3 討論

高齡女性隨著卵巢儲備功能下降，表現(xiàn)為竇卵泡減少及其分泌的AMH降低。本研究高齡組血清AMH、雙側卵巢竇卵泡數(shù)均低于非高齡組，與之相符。卵細胞在發(fā)育成熟各個階段依靠外界反饋調節(jié)的調控，而卵泡液正是這些調控信息的重要媒介。經(jīng)蛋白質組學分析卵泡液的成分，能夠了解卵細胞的發(fā)育狀況和質量。本研究對卵泡液進行蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)，卵泡液蛋白質組學特征與全身整體功能具有高度一致性，即隨著年齡增大，婦女體內能量代謝過程漸趨失調，尤其表現(xiàn)在糖、脂代謝受損[4]。例如，高齡女性卵泡液中高表達的IGFBP7能阻礙胰島素發(fā)揮生物效應，引起胰島素抵抗；APOB存在于低密度脂蛋白的表面，APOB表達增多時表示體內低密度脂蛋白水平與高密度脂蛋白比例升高[5]。本研究也發(fā)現(xiàn)了幾個差異表達的免疫和凝血相關蛋白質，因其功能比較復雜，與年齡的關系尚不明確。

差異表達蛋白質GO及KEGG富集分析顯示，高齡女性卵泡液蛋白質組學顯現(xiàn)出了較為明顯的細胞凋亡、增殖與分化調節(jié)方面的變化。本研究鑒定到的TIMP-1可以結合MMPs并降低其生物活性，從而抑制MMPs的凋亡效應[6]。IGF是目前研究發(fā)現(xiàn)最成熟的促進顆粒細胞增殖的因子，其高表達常反映卵細胞增殖活性增強，而IGFBP-3、IGFBP-6及IGFBP7均可以競爭性抑制IGF活性的發(fā)揮[7，8]。本研究顯示，高齡女性卵泡液中IGFBP-3、IGFBP-6、IGFBP7表達上調，提示其存在凋亡效應增強。HGFAC是多種細胞類型的促分裂原，TGFβI在細胞增殖分化過程中有重要調控功能。本研究顯示，高齡女性卵泡液中HGFAC、TGFβI表達下調，提示其存在增殖、分化效應的抑制。

TNF在細胞凋亡過程中起著重要作用，而TNFRSF1A與Fas相關的死亡結構域結合可激活FADD引起細胞凋亡，TRAF6具有細胞凋亡和抑制炎癥反應的雙重作用[9，10]。本研究結果顯示，高齡女性卵泡液中TRAF6表達上調，同樣也顯示出其凋亡效應的增強；而TNFRSF1A的表達下調理論上應為凋亡效應抑制，可能與促排卵激素的使用有關，其原因與意義尚待進一步研究。RBP4不僅與胰島素抵抗、糖尿病等有關，還能阻止卵細胞的減數(shù)分裂進程，使生長分化因子9和BMP15表達下調[11]。本研究中高齡女性卵泡液RBP4表達上調，提示凋亡效應增強并抑制卵母細胞成熟。SYCP2是生殖細胞減數(shù)分裂過程中不可或缺的一種蛋白質[12]，CCDC112下調可以導致出現(xiàn)細胞周期的阻滯[13]。本研究中高齡女性卵泡液SYCP2、CCDC112表達下調，也顯示出其增殖、分化效應抑制，阻礙卵細胞成熟，這與高齡婦女卵巢功能變化規(guī)律相符。

總之，高齡女性卵泡液蛋白質組學代謝功能總體趨勢是細胞凋亡加劇，增殖與分化修復能力下降，從而導致卵泡凋亡加速、卵細胞質量下降[14，15]，這就使得高齡女性受孕率降低而自然流產(chǎn)率升高。目前臨床上已有大量研究表明，在高齡女性促排卵過程中，通過添加生長激素促進卵泡增殖和修復功能、改善卵細胞質量是有效的[16～18]，這也證實了本研究的結果。由于卵泡液的主要來源是血清，血清蛋白不可避免地對卵泡液蛋白具有“摻雜”影響，為了將干擾因素控制到最低，提高結果的準確性，在后續(xù)研究中除了擴大樣本量，我們考慮首先進行血清差異表達蛋白的比較，并在卵泡液差異表達蛋白比較時“屏蔽”血清差異表達蛋白，對卵泡液中微小差異表達蛋白進行放大，以最大程度保留和呈現(xiàn)女性卵巢蛋白質組學代謝的過程。