補(bǔ)腎壯筋湯含藥血清介導(dǎo)的Sox9基因高表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制研究

吳鋒鋒 高宏梁 王國榮 李建有 黃 勝 蔣雪生 李雄峰

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是老年人最常見的關(guān)節(jié)炎，可引起關(guān)節(jié)慢性疼痛并可導(dǎo)致殘疾?？诜晴摅w抗炎藥可快速緩解早期的癥狀，但不能明顯延緩疾病的進(jìn)程，且這類藥物長期服用有很多不良反應(yīng)，特別是消化道的不良反應(yīng)[1]。因此,尋找更加可靠的藥物替代方案一直是OA治療的目標(biāo)[2]。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，OA屬于“骨痹”、“痹癥”等范疇?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗?曰：“丈夫……七八肝氣衰，筋不能動，天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極”。可見其多因肝腎虧虛、筋脈失養(yǎng)而發(fā)病。補(bǔ)腎壯筋湯(BZD)出自清代錢秀昌《傷科補(bǔ)要》，其中熟地黃、山茱萸填精益髓、滋補(bǔ)肝腎，續(xù)斷、杜仲補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，五加皮、茯苓健脾利濕，青皮理氣，白芍、當(dāng)歸補(bǔ)血活血，牛膝補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨。諸藥合用，起到補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋壯骨的功效，是我國著名的OA治療成方。臨床試驗(yàn)顯示，BZD可顯著改善OA患者的癥狀和體征[3,4]。

然而，BZD作用的分子機(jī)制仍不清楚，可能是非常復(fù)雜和多方面的。Lin等[5]研究發(fā)現(xiàn)，BZD可增強(qiáng)衣霉素 (TM)刺激的軟骨細(xì)胞活力，抑制由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的TM誘導(dǎo)的SD大鼠軟骨細(xì)胞凋亡。SRY-box 9(Sox9)基因在軟骨發(fā)育中起重要作用，是軟骨間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。此外，它還參與調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化的各個階段[6]。先前的研究表明，Sox9的過表達(dá)可促進(jìn)軟骨修復(fù)[7]。因此，本研究目的是確定BZD是否可通過提高Sox9的表達(dá)來保護(hù)OA細(xì)胞模型中的軟骨細(xì)胞，并闡明其潛在的機(jī)制。

材料與方法

1.材料：4周齡雄性SD大鼠16只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：2017-0008，飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(SPF)動物房中，其中4只用于制備BZD含藥血清，12只用于分離軟骨細(xì)胞。其他主要材料：DMEM培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；膠原蛋白Ⅱ多克隆抗體(142kDa，Ab34712)、Sox9多克隆抗體 (70kDa，Ab185966)購自英國Abcam公司，稀釋度分別為1∶5000和1∶1000；蛋白聚糖Aggrecan單抗(250kDa，NB600-504)購自美國Novus公司，稀釋度為1∶100；RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)科研倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號2017123。

2.方法：(1)BZD含藥血清的制備：BZD是中藥飲片，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，含10味中藥，包括熟地黃、山茱萸、續(xù)斷、杜仲、五加皮、白芍、當(dāng)歸、茯苓、青皮、牛膝，其最終濃度為1g/ml(相當(dāng)于原料的干重)。BZD(18.5g/kg，相當(dāng)于成人1次的劑量)連續(xù)給藥7天(每天2次)。最后1次給藥2h后，處死大鼠(n=4)，從頸動脈取血。血樣在4℃下凝血2h， 上清液1500r/min離心20min，56℃失活30min，過濾后-80℃保存。(2)軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)：從大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞(n=12)，并按先前已報道的方法進(jìn)行鑒定[4]。將軟骨細(xì)胞先用0.1%胰蛋白酶預(yù)消化30min，再用1.5mg/ml的膠原酶Ⅱ消化16h，離心后收集細(xì)胞。分離的軟骨細(xì)胞在10%胎牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，同時加入青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml，放在37℃含5%二氧化碳的孵育器中。(3)實(shí)驗(yàn)分組：選取第2代(P2)軟骨細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)被證明是膠原蛋白Ⅱ含量豐富，能表現(xiàn)出典型的軟骨細(xì)胞形態(tài)[3,4]。軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為3組,即對照組，P2軟骨細(xì)胞不予任何干預(yù)；模型組, IL-1β(10μg/ml)刺激P2軟骨細(xì)胞24h; BZD組，IL-1β(10μg/ml)刺激P2軟骨細(xì)胞24h，然后加入BZD含藥血清(400μg/ml)。BZD干預(yù)72h后收集所有軟骨細(xì)胞進(jìn)行分析。(4)軟骨細(xì)胞活性測定：采用MTT比色法檢測BZD對軟骨細(xì)胞活性的影響。BZD給藥72h后，3組細(xì)胞中各加入0.5mg/ml MTT溶液，37℃孵育4h，棄上清液,將晶體溶解在100μl二甲基亞砜(DMSO)溶液中。使用酶標(biāo)儀(美國Hercules公司)在570nm處讀取吸光度。(5)Sox9、蛋白聚糖aggrecan、膠原蛋白Ⅱ蛋白水平的測定：采用細(xì)胞裂解液(RIPA∶PMSF∶Cocktail =100∶1∶2)于冰上裂解細(xì)胞，BCA法檢測蛋白濃度。取150μg蛋白經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用5% BSA室溫封閉40min，蛋白一抗冰上過夜孵育，二抗室溫孵育60min，采用雙色紅外激光成像系統(tǒng)采集圖像。每組重復(fù)3 次。(6)Sox9、蛋白聚糖aggrecan(Acan)、膠原蛋白Ⅱ(Col2a1)基因水平的測定：采用Trizol法提取軟骨細(xì)胞總RNA，超微量核酸分析儀檢測總RNA的濃度與純度。采用美國Promega公司試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，按照試劑盒說明書操作。反應(yīng)步驟: 95℃ 5min，95℃ 10s，58℃ 1min，共30個循環(huán)。以2-ΔΔCT表示相對表達(dá)量。Sox9引物序列：上游引物5′-GCGAGCAGCAGCAGCACTC-3′，下游引物5′-TCTGGTGGTCGGTGTAGTCATACTG-3′。Acan引物序列：上游引物5′-CCAGTCTACCCAGCACCCTA-3′，下游引物5′-TCAGGGACTTGGCTGTTTCT-3′。Col2a1引物序列：上游引物5′-GGCTCCCAGAACATCACCTA-3′，下游引物5′-GCCCTCATCTCCACATCATT-3′。內(nèi)參基因Gapdh引物序列：上游引物5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

結(jié) 果

1. 分離培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞的形態(tài)及其鑒定：倒置顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞，結(jié)果顯示培養(yǎng)9～12h部分細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)至24h絕大部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞開始伸展，細(xì)胞體積較小，呈多角形，均勻散在生長(圖1A)。3天左右細(xì)胞匯合成單層鋪滿整個培養(yǎng)瓶底部。4天左右首次傳代后增殖速度加快，隔天可再次傳代，呈明顯的“鋪路石”樣(圖1B)。傳至第6代，細(xì)胞呈長梭型，開始老化。第7代后細(xì)胞呈梭狀平鋪，折光差，部分細(xì)胞脫落，生長速度減慢，傳代周期延長，軟骨細(xì)胞表型退化。由于Ⅱ型膠原的合成與分泌是軟骨細(xì)胞維持其分化表型的特定指標(biāo)。細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示，培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞胞質(zhì)中Ⅱ型膠原的棕黃色顆粒較多，呈強(qiáng)陽性表達(dá)，可見典型的軟骨細(xì)胞形態(tài)(圖1C)。

2．IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷：對照組表現(xiàn)為基本正常的軟骨細(xì)胞形態(tài)(圖2A),模型組出現(xiàn)軟骨細(xì)胞的肥大和萎縮等軟骨細(xì)胞損傷的征象(圖2B),BZD組軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)的損傷較模型組減輕(圖2C)。

3.軟骨細(xì)胞活性：與對照組比較，模型組中軟骨細(xì)胞活性顯著降低(P=0.000)，BZD組和模型組比較，軟骨細(xì)胞活性增強(qiáng)(P<0.05)，詳見圖3。

4.Sox9、蛋白聚糖aggrecan和膠原蛋白Ⅱ的基因和蛋白表達(dá)：與對照組比較，模型組Sox9、蛋白聚糖aggrecan和膠原蛋白Ⅱ的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著降低 (P=0.000)。在BZD組, Sox9、蛋白聚糖和膠原蛋白Ⅱ的基因和蛋白表達(dá)水平較模型組均顯著升高(P<0.05,圖4、圖5)。

討 論

關(guān)節(jié)軟骨的破壞和丟失是OA的一個主要特征。軟骨細(xì)胞是軟骨中唯一的細(xì)胞，嵌入在廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中，ECM主要由膠原和蛋白多糖組成，關(guān)節(jié)軟骨中的膠原主要為Ⅱ型，關(guān)節(jié)軟骨的主要蛋白多糖為aggrecan[8]。Sox9是一種轉(zhuǎn)錄因子，它對許多軟骨細(xì)胞ECM基因的表達(dá)至關(guān)重要，并在軟骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮作用[7]。BZD在中國長期被用于OA患者的治療，臨床研究表明，BZD可改善OA患者的癥狀[3,4]。然而，BZD在OA中的分子機(jī)制尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)BZD通過刺激SD大鼠的細(xì)胞周期進(jìn)程促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖[9]。也有研究表明，補(bǔ)腎壯筋湯可清除氧自由基，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，抑制滑膜炎癥，提高軟骨細(xì)胞抗異常應(yīng)力水平[10]。

本研究結(jié)果顯示，BZD提高了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Sox9、蛋白聚糖aggrecan和膠原蛋白Ⅱ的表達(dá), 從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的活性。Sox9是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種器官和組織的發(fā)育，尤其是軟骨形成。值得注意的是，Sox9可轉(zhuǎn)錄激活許多軟骨特異性結(jié)構(gòu)成分和調(diào)節(jié)因子的基因[11]。在正常軟骨細(xì)胞中，Sox9調(diào)控蛋白聚糖aggrecan和膠原蛋白Ⅱ的表達(dá)[11]。正常的關(guān)節(jié)軟骨依賴于合成和分解細(xì)胞因子之間的平衡。IL-1β是促炎性細(xì)胞因子和分解代謝的關(guān)鍵因子，導(dǎo)致金屬基質(zhì)蛋白酶的產(chǎn)生、減少膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖aggrecan的表達(dá)[12]。在最近的研究中，IL-1β被用來建立SD大鼠軟骨細(xì)胞的細(xì)胞OA模型。本研究在IL-1β的影響下，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)Sox9、膠原蛋白Ⅱ和aggrecan的快速減少。重要的是， BZD可緩解IL-1β的作用，進(jìn)一步支持BZD在 Sox9的信號通路的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果支持使用BZD作為一種有效的藥物治療OA。它可能通過參與關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和功能的Sox9及其靶基因的正向調(diào)控，刺激細(xì)胞增殖。但是，BZD對動物模型和OA患者Sox9信號通路的調(diào)控還有待于進(jìn)一步研究。