實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在手足口病檢測(cè)中的應(yīng)用

趙禹

[摘要] 目的 探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在手足口病檢測(cè)中的應(yīng)用。 方法 選擇本溪市疾病預(yù)防控制中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口病患兒作為研究對(duì)象，根據(jù)檢測(cè)方法不同分為對(duì)照組和觀察組。對(duì)照組利用常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)手足口病組，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)手足口病為觀察組。比較兩組的檢出腸道病毒分型EV、EV71、CoxA16陽性率，特異性和靈敏度。 結(jié)果 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)手足口病腸道病毒分型EV、EV71、CoxA16的陽性率及兩組特異性和靈敏度相比，觀察組檢測(cè)陽性率為66.67%，明顯高于對(duì)照組檢測(cè)陽性率的21.67%，觀察組檢出陽性率高于對(duì)照組，兩組均有特異性，觀察組靈敏度優(yōu)于對(duì)照組，對(duì)照組最低檢測(cè)限均為4.11×103 cfu/mL。而觀察組均為4.11×102 cfu/mL。 結(jié)論 熒光定量PCR技術(shù)在檢測(cè)腸道病毒中不僅具有特異性高，還具有靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間快的特點(diǎn)，有助于更快診斷手足口病，更好的服務(wù)于臨床。

[關(guān)鍵詞] 手足口病;熒光定量PCR;柯薩奇病毒A組16型;腸道病毒71型

[中圖分類號(hào)] R440 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）15-0148-03

Application of real-time fluorescent quantitative PCR technology in detection of hand-foot-mouth disease

ZHAO Yu

Department of Microbiology， Benxi Center for Disease Prevention and Control in Liaoning Province， Benxi ? 117000， China

[Abstract] Objective To explore the application of real-time fluorescent quantitative PCR technology in the detection of hand-foot- mouth disease. Methods A total of 120 children with hand-foot-mouth disease treated in Benxi Center for Disease Prevention and Control from February 2018 to June 2019 were selected as research subjects. They were divided into the control group and the observation group according to different detection methods. Patients with hand-foot-mouth disease detected by conventional PCR technology were classified as the control group， and those detected by real-time fluorescent quantitative PCR technology were classified as the observation group. The positive rates， specificity， and sensitivity of enterovirus（EV） typing， enterovirus 71（EV71）， and coxsackievirus A16（CoxA16） were compared between the two groups. Results The positive rates of EV typing， EV71， and CoxA16， specificity and sensitivity in detection of hand-foot-mouth disease using real-time fluorescent quantitative PCR and conventional PCR were compared. The positive rates in the observation group and the control group were 66.67% and 21.67%， respectively. The positive rate in the observation group was significantly higher than that in the control group. Specificity was showed in both groups. The sensitivity in the observation group was higher than that in the control group. The minimum detection limit of the control group was 4.11×103 cfu/mL and that of the observation group was 4.11×102 cfu/mL. Conclusion Fluorescent quantitative PCR technology is with high specificity， high sensitivity and fast detection time， which benefits the faster diagnosis of hand-foot-mouth disease and serves clinical care better.

[Key words] Hand-foot-mouth disease; Fluorescent quantitative PCR; Coxsackievirus A16; Enterovirus 71

手足口病主要致病菌是腸道病毒，該傳染病的主要傳播途徑是通過消化道、呼吸道和密切接觸等[1]，人群較易受感染，但多見于嬰幼兒。其發(fā)病率最高人群為5歲以下兒童，腸道病毒可以引起多種傳染病如脊髓灰質(zhì)炎、柯薩奇病毒、手足口病等，但引起手足口病最為常見的是腸道病毒71型（Human enterovirus 71， EV71）和柯薩奇病毒A組16型（CoxsackievirusA16，CoxA16），但近年來引起并發(fā)癥主要以EV71分型為主，該病的發(fā)病流行特點(diǎn)是一年四季均可以發(fā)病，尤以夏秋季節(jié)最多見[2]。臨床表現(xiàn)以手、足、口腔等部位的斑丘疹、皰疹為特征，但部分的EV71感染者可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、神經(jīng)性肺水腫、心肌炎、循環(huán)障礙等危重并發(fā)癥，感染腸道病毒分型EV71是死亡的主要原因，目前缺乏有效的治療藥物，本病傳染性強(qiáng)，易引起暴發(fā)或流行[3]。以前的實(shí)驗(yàn)室診斷手足口病中的腸道病毒病原體的方法是血清學(xué)方法和病毒分離培養(yǎng)，但這兩種方法有檢測(cè)速度慢、耗時(shí)長(zhǎng)的局限性，且對(duì)專業(yè)人員的技術(shù)要求門檻高，無法準(zhǔn)確對(duì)暴發(fā)疫情做出應(yīng)有的診斷和治療，因此本文選擇我中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口患兒作為研究對(duì)象，并取得了較好的療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本溪市疾病預(yù)防控制中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口病患兒的病歷資料，根據(jù)檢測(cè)方法不同分為對(duì)照組和觀察組，每組各60例。對(duì)照組男48例，女12例;年齡0～4歲，平均（3.50±0.35）歲;病程2～10 d，平均（7.78±0.81）d;觀察組：男37例，女23例;年齡0～3歲，平均（2.40±0.47）歲，病程3～9 d，平均（7.53±0.77）d。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)腸道病毒傳染者;出現(xiàn)口痛、厭食、低熱者。手、足、口腔等部位出現(xiàn)小皰疹或小潰瘍且大多1周左右可自愈者。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有其他感染癥狀者;手、足、口腔等部位有皰疹或潰瘍且較難自愈者;免疫力低下者;嚴(yán)重心、肝、腎功能異常者[4]。幼兒手足、臀部皮疹及口腔皰疹和潰瘍的臨床表現(xiàn)應(yīng)考慮手足口病。臨床診斷具有下列之一的特點(diǎn)即可確診為手足口?。阂弧⒛c道病毒特異性核酸（EV71、CoxA16）檢測(cè)陽性;二、分離腸道病毒病并鑒定為EV71、CoxA16或者其他腸道病毒;三、急性期與恢復(fù)期血清腸道病毒特異性中和抗體滴度4倍以上。手足口病診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照《感染病學(xué)八年制教材第3版》[5]進(jìn)行。兩組患者的性別、年齡等資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。該研究得到本溪市疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，每例患兒家屬均簽署了知情同意書。

1.2 標(biāo)本運(yùn)送和保存

相應(yīng)的科室采集后的標(biāo)本應(yīng)存放于相應(yīng)的標(biāo)本保存液，及時(shí)冷藏運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室以免耽誤最佳檢測(cè)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣本完成后應(yīng)立即放入-80℃ 冰箱保存。低溫保存使病原體的活性降低。

1.3 主要儀器及試劑

實(shí)時(shí)熒光PCR儀購于美國應(yīng)用系統(tǒng)公司ABI7500，凝膠成像儀購于美國BIO-Rad UV HOODⅡ。RNA提取、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑均購自美國QIAGEN公司;腸道病毒通用型核酸檢測(cè)試劑盒（Human enterovirus，EV）、（EV71）和（Cox A16）均購于上海之江公司生產(chǎn)，瓊脂糖購自GIBIO公司。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。引物探針EV、EV71 和 Cox A16序列在Gen Bank數(shù)據(jù)庫搜索且設(shè)計(jì)。常規(guī)PCR引物序列參考《手足口病防控指南》中的引物設(shè)計(jì)，由生工公司合成。

1.4 操作方法

1.4.1 熒光定量PCR檢測(cè)手足口病的病原體的操作標(biāo)準(zhǔn) ?流程嚴(yán)格按照購買試劑盒的方法執(zhí)行，先按照試劑盒提取病毒RNA后按PCR總體系25 μL和PCR反應(yīng)條件：45℃10 min→95℃15 min→95℃15 s → 60℃60 s循環(huán)40次進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4.2 ?常規(guī)PCR檢測(cè)手足口病的病原體操作標(biāo)準(zhǔn) ?流程如下：先用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物由特定的生物公司合成，其次試劑盒提取病毒RNA，PCR總體系25 μL依次加入Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)液，質(zhì)控液等。PCR反應(yīng)條件：45℃10 min→95℃15 min→95℃15 s→60℃60 s循環(huán)40次進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)束后2%瓊脂糖進(jìn)行電泳，用凝膠成像儀觀察 PCR產(chǎn)物并拍照電泳結(jié)果。

1.5 觀察指標(biāo)

觀察并記錄兩組腸道病毒分型EV、EV71、CoxA16陽性率、特異性、靈敏度。該研究陽性率通過χ2檢驗(yàn)計(jì)算而得，該研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)方法和常規(guī)PCR技術(shù)方法分別檢測(cè)腸道病毒的陰性和陽性來確定其特異性。檢測(cè)系列稀釋的已知拷貝數(shù)的RNA 濃度根據(jù)最低效價(jià)比來確定其靈敏度[6]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腸道病毒陽性率檢測(cè)結(jié)果比較

對(duì) 120份咽拭子標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行兩種方法的檢測(cè)，其中觀察組檢測(cè)陽性率為66.67%，明顯高于對(duì)照組檢測(cè)陽性率的21.67%。觀察組檢出 EV陽性13份，EV 71陽性19份、Cox A16陽性8份，陰性份數(shù)20份，對(duì)照組檢出 EV陽性5份，EV 71陽性6份、Cox A16陽性2份，陰性份數(shù)47份。觀察組檢出陽性率高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組腸道病毒及分型的特異性比較

兩組通過腸道通用反應(yīng)液、V71反應(yīng)液、CoxA16對(duì)腸道病毒EV、EV71、CoxA16、諾如病毒、輪狀病毒進(jìn)行特異性比較，發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)果一致，說明兩組對(duì)檢測(cè)手足口病均有特異性。見表2。

2.3兩種方法檢測(cè)腸道病毒的靈敏度分析

將手足口病菌懸液濃度為4.11×107 cfu/mL 進(jìn)行 10 倍梯度稀釋，比較兩種方法的檢測(cè)手足口病的靈敏度，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組最低檢測(cè)限均為4.11×103 cfu/mL。而觀察組最低檢測(cè)限均為4.11×102 cfu/mL，由此可知觀察組的檢測(cè)靈敏度高于對(duì)照組。見表3。

3 討論

手足口病的發(fā)病機(jī)制是病毒從咽部或腸道侵入，在局部黏膜和淋巴組織中繁殖并引起局部的癥狀[7]。該病的臨床特征是低熱、手、足、口腔等出現(xiàn)小皰疹或者小潰瘍，絕大數(shù)患兒7 d左右自愈，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥[8]。該病流行特點(diǎn)是有明顯的季節(jié)性和聚集性。該病分布廣泛，傳播速度較快且傳染性強(qiáng)，隱性感染者居多，顯性感染者和隱性感染者之比為1：100[9]，所以早期發(fā)現(xiàn)該病有利于疾病的控制。既往引起手足口病的病毒CoxA16，之后發(fā)現(xiàn)EV71病毒才是引起本病的危險(xiǎn)因素，本研究發(fā)現(xiàn)分離EV71陽性率高于CoxA16，與國內(nèi)數(shù)次暴發(fā)的此病的特點(diǎn)具有一致性[10]。早期用于檢測(cè)腸道病毒的方法是血清學(xué)方法和病毒分離法，但兩種方法具有操作復(fù)雜、耗時(shí)、準(zhǔn)確率低的特點(diǎn)，不能滿足快速診斷該病的需要[11-13]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來國內(nèi)常用檢測(cè)手足口病的方法是常規(guī)PCR方法，雖然此方法也可以快速檢測(cè)病毒核酸，但易產(chǎn)生污染，且此過程需要溴化乙錠等染料具有致癌性。熒光定量PCR技術(shù)是目前國際上檢測(cè)手足口病病毒最先進(jìn)的檢查方法，因?yàn)闊晒舛縋CR技術(shù)具有以下的優(yōu)點(diǎn)：一、高靈敏性和準(zhǔn)確性，對(duì)于DNA濃度要求低。二、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少。三、安全、無污染，因?yàn)槎荚诜忾]狀態(tài)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析，不需要瓊脂糖電泳和紫外照射。四、結(jié)果重復(fù)性好，實(shí)時(shí)觀測(cè)結(jié)果、判斷直觀、避免人為因素干擾[14]。熒光定量PCR技術(shù)在檢測(cè)手足口病病毒全程只需3個(gè)多小時(shí)，為快速診斷手足口病提供最快的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，有助于手足口疫情的監(jiān)測(cè)。

本研究同時(shí)采用兩種PCR技術(shù)檢測(cè)手足口病病原體，此兩種實(shí)驗(yàn)技術(shù)分別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR和常規(guī)PCR。且這兩種方法檢測(cè)手足口病的陽性率分別為66.67%和21.67%，此次研究結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)手足口病陽性率明顯高于常規(guī)PCR，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明實(shí)時(shí)熒光定量PCR避免漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，為臨床提供準(zhǔn)確的結(jié)果有利于早發(fā)現(xiàn)疫情。該研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)方法和常規(guī)PCR技術(shù)方法分別檢測(cè)腸道病毒的陰性和陽性來確定其特異性，發(fā)現(xiàn)兩者檢測(cè)陰性和陽性是一致的，所以兩者方法都具有特異性，證明采用PCR技術(shù)診斷該病具有特異性，防止臨床上漏診誤診的風(fēng)險(xiǎn)。通過檢測(cè)系列稀釋的已知拷貝數(shù)的RNA 濃度根據(jù)最低效價(jià)比來確定其靈敏度，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組最低檢測(cè)限均為4.11×103 cfu/mL。而觀察組最低檢測(cè)限均為4.11×102 cfu/mL，證明熒光定量PCR技術(shù)具有更高的靈敏性，有利于疾病的檢出。此研究與王冰等[15]研究結(jié)果一致，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比常規(guī)PCR技術(shù)在檢測(cè)手足口病更有優(yōu)勢(shì)，為臨床手足口病防治提供了依據(jù)。

綜上所述，熒光定量PCR技術(shù)在檢測(cè)腸道病毒不僅具有特異性高，還具有靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間快的特點(diǎn)，有助于更快診斷手足口病，更好的服務(wù)于臨床。

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（收稿日期：2019-12-13）