基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的吳茱萸抗腫瘤作用機(jī)制研究

曾以旺

[摘要] 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究吳茱萸抗腫瘤的作用機(jī)制。 方法 采用活性成分篩選、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)手段，預(yù)測(cè)吳茱萸抗腫瘤的潛在作用靶點(diǎn)，并進(jìn)行信號(hào)通路分析，從而探討其治療腫瘤的分子機(jī)制。 結(jié)果 吳茱萸在TCMSP數(shù)據(jù)中搜索得到30個(gè)相應(yīng)成分，同時(shí)利用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)共篩選出相關(guān)靶點(diǎn)123個(gè)。同時(shí)在疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到21 365個(gè)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的已知靶點(diǎn)基因，利用String數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件中的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龉埠Y選得出關(guān)鍵靶點(diǎn)5個(gè)。 結(jié)論 吳茱萸作為中藥對(duì)腫瘤的作用具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 吳茱萸;抗腫瘤;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用靶點(diǎn);作用機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R285 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）15-0131-05

Study of anti-tumor mechanism of action of Evodia rutaecarpa based on network pharmacology

ZENG Yiwang

Department of Pharmacy， Ganzhou People's Hospital， Ganzhou ? 341000， China

[Abstract] Objective To study anti-tumor mechanism of action of Evodia rutaecarpa based on network pharmacology. Methods The potential anti-tumor targets of Evodia rutaecarpa were predicted by active ingredient screening and target prediction technology combined with bioinformatics methods， and the signal pathway analysis was carried out to explore the molecular mechanism of tumor treatment. Results When Evodia rutaecarpa was searched in TCMSP database， 30 corresponding components were found， and 123 related targets were screened by target prediction technology. Meanwhile， 21，365 known target genes related to tumorigenesis and tumor development were retrieved from the disease gene database， and 5 key targets were selected through String database and network topology analysis in the software of Cytoscape. Conclusion As a traditional Chinese medicine， Evodia rutaecarpa has an effect on tumors which is featured multi-component， multi-target and synergistic.

[Key words] Evodia rutaecarpa; Anti-tumor; Network pharmacology; Target of action; Mechanism of action

腫瘤是指機(jī)體在各種致瘤因子的作用下，局部組織細(xì)胞增生所形成的新生物。近年來(lái)， 腫瘤發(fā)病率呈高發(fā)趨勢(shì)，病死率逐年上升，已經(jīng)嚴(yán)重威脅了人類的生命安全。中醫(yī)對(duì)腫瘤早有記載， 宋代之前將生于體內(nèi)的腫瘤稱為癥瘕、積聚等?！吨T病源候論》記載：“積聚者，由陰陽(yáng)不和，臟腑虛弱，受于風(fēng)邪，搏于臟腑之氣所為也”?！毒霸廊珪诽峒啊捌⒛I不足及虛弱失調(diào)之人，多有積聚之病”。中醫(yī)認(rèn)為腫瘤是正氣不足、臟腑失調(diào)而導(dǎo)致氣滯血瘀、痰凝毒聚、毒熱蘊(yùn)結(jié)形成腫塊，名曰“瘤”、“巖”[1]。目前對(duì)于腫瘤的治療手段主要有手術(shù)、化療、放療等，化療藥物種類繁多，具有良好的治療效果，但毒副作用較大，長(zhǎng)期應(yīng)用后腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性。中藥是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，許多中藥通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑、多效應(yīng)治療腫瘤，同時(shí)具有不良反應(yīng)少、機(jī)體耐受性好等優(yōu)勢(shì)，在治療惡性腫瘤方面發(fā)揮了重要作用[2]。

吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.） Benth. var. officinalis（Dode） Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.） Benth. var. bodinieri（Dode） Huang的干燥近成熟果實(shí)，性味辛、苦、熱;有小毒;歸肝、脾、胃、腎經(jīng);有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉的功效[3]。現(xiàn)代研究表明，吳茱萸能夠抑制腫瘤細(xì)胞活性與增殖、阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬、抑制腫瘤微血管形成與腫瘤遷移[4]，因此吳茱萸常以單方或復(fù)方的形式被廣泛用于腫瘤相關(guān)疾病，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的原理闡釋疾病發(fā)展的過(guò)程，進(jìn)一步利用網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀來(lái)認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體相互作用的一種新興技術(shù)，具有“多基因、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)，開創(chuàng)了一種多靶點(diǎn)與多種疾病間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系的新型模式，在復(fù)雜疾病發(fā)病機(jī)制及治療靶標(biāo)的研究方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，這與中醫(yī)藥整體觀與辨證論治的原則相契合[6-7]。因此，構(gòu)建中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)動(dòng)態(tài)的藥動(dòng)學(xué)模型，可以從機(jī)制方面表征藥物對(duì)疾病進(jìn)展的影響，對(duì)分析藥物間相互作用和穩(wěn)態(tài)反饋機(jī)制具有重要意義[8]。因此，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究吳茱萸抗腫瘤的多成分、多靶點(diǎn)和多通路作用機(jī)制，以期為吳茱萸的臨床使用提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

活性成分及靶點(diǎn)的獲?。篢CMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）;靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因的查找：Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/）;疾病靶點(diǎn)的獲?。篏enecards數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org/）;關(guān)系圖的繪制：Draw Venn網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）;交互網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：Cytoscape3.7.1軟件;通路分析：Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//metascape.org/gp/）及DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 吳茱萸活性成分的獲取與篩選

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp. nwu. edu. cn/tcmsp.php），獲取吳茱萸的化學(xué)成分;通過(guò)口服利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）對(duì)吳茱萸相關(guān)活性成分進(jìn)行篩選，得出吳茱萸目標(biāo)活性成分。

2.2 活性成分作用靶點(diǎn)的獲取

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得目標(biāo)成分所對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，并在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/）中查找作用靶點(diǎn)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)基因，刪掉重復(fù)項(xiàng)后得到目標(biāo)成分對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)。

2.3 “目標(biāo)成分―對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述獲得的成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，建立吳茱萸“成分-靶點(diǎn)”知識(shí)網(wǎng)絡(luò)，以直觀地研究各成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

2.4 疾病靶點(diǎn)的獲取

基于Genecards、TTD、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)獲取與腫瘤相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.5 吳茱萸抗腫瘤作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

將上述兩步得到的吳茱萸目標(biāo)活性成分靶點(diǎn)與抗腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venn數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）進(jìn)行交互分析，獲得交集靶點(diǎn)，建立吳茱萸目標(biāo)成分-疾病-靶點(diǎn)的信息網(wǎng)絡(luò)。

2.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將交互靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/cgi/），只計(jì)算物種為Homo sapiens的蛋白相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，以節(jié)點(diǎn)（node）和邊（edge）表示靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)程度。同時(shí)采用Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行拓?fù)浞治?，并運(yùn)用中位數(shù)卡方原則，經(jīng)“Dgreement”和“Clossment”參數(shù)比對(duì)確定關(guān)鍵靶點(diǎn)[9]。

2.7 富集分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入FUNRich 6.0軟件，物種限定為Homo sapiens，對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)所涉及的細(xì)胞功能（CC）、分子功能（MF）、生物功能（BP）和信號(hào)通路（PW），以P值<0.05為閾值，完成關(guān)鍵靶點(diǎn)的富集分析。

3 結(jié)果

3.1 吳茱萸活性成分的獲取

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取吳茱萸的化學(xué)成分，通過(guò)篩選符合口服利用度（OB）≥30%以及類藥性（DL）≥0.18的化學(xué)成分，并結(jié)合ADME分析[10]，篩選得到符合條件的活性成分共計(jì)30個(gè)，化合物具體信息見表1。

3.2 吳茱萸抗腫瘤的相關(guān)靶點(diǎn)信息

將從 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合文獻(xiàn)挖掘方法收集到的基因進(jìn)行整理，刪除重復(fù)項(xiàng)后共123個(gè)相關(guān)靶點(diǎn);采用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與腫瘤相關(guān)的靶點(diǎn)共21 365個(gè)，建立腫瘤疾病靶點(diǎn)庫(kù);將收集到的吳茱萸成分靶點(diǎn)與腫瘤疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交互分析，結(jié)果顯示吳茱萸目標(biāo)成分所對(duì)應(yīng)的123個(gè)靶點(diǎn)中有113個(gè)與腫瘤有關(guān)。見封三圖9、表2。

3.3 PPI分析結(jié)果

將交互基因信息導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置每個(gè)靶點(diǎn)要顯示的最大交互程序數(shù)不超過(guò)50條，獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)圖（封三圖10），其中節(jié)點(diǎn)有113個(gè)，邊有1066條，實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋吳茱萸抗腫瘤的各個(gè)靶點(diǎn)之間聯(lián)系緊密。同時(shí)采用中位數(shù)原則，經(jīng)“Dgree ment”和“Clossment”參數(shù)進(jìn)行篩選，共得到5個(gè)主要的靶點(diǎn)：MAPK14、PDE10A、ACACA、EGFR、IL1B。

3.4 GO分析和KEGG富集分析

采用FUNRich和KORAS數(shù)據(jù)對(duì)交互靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析結(jié)果，見圖1。細(xì)胞組分（CC）分析數(shù)據(jù)表明吳茱萸可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外空間環(huán)境，改變細(xì)胞膜表面受體表達(dá)能力以及細(xì)胞器活動(dòng)等。分子功能（MF）分析得出吳茱萸可直接影響G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)活性、配體依賴性核受體相關(guān)蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、肽酶活性、細(xì)胞外配體門控離子通道活性、細(xì)胞因子活性、跨膜受體蛋白活性、催化活性、輔因子結(jié)合、電壓門控離子通道活性等多途徑發(fā)揮抗腫瘤活性。同時(shí)生物途徑（BP）分析得出吳茱萸可影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝、細(xì)胞通訊和信號(hào)傳導(dǎo)、核心蛋白代謝等途徑來(lái)干預(yù)腫瘤細(xì)胞增殖。

信號(hào)通路分析結(jié)果得出（圖2），吳茱萸可直接干預(yù)IL-3、IL-5等相關(guān)炎癥家族、雷帕霉素（mTOR）、γ-IFN等30條信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤活性。這一結(jié)果解釋吳茱萸可抑制腫瘤細(xì)胞能量代謝通路和炎癥通路，從而阻斷炎癥浸潤(rùn)的出現(xiàn);并激活細(xì)胞自噬通路，加快腫瘤細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

腫瘤根據(jù)其臨床特點(diǎn)，在中醫(yī)范疇內(nèi)被稱為癥瘕、積聚等。腫瘤細(xì)胞歸屬于“邪氣”，常見腫瘤患者臨床癥見腫塊、出血、臟器梗阻等。由吳茱萸組成的方劑中最常用的為“左金丸”，出自《丹溪心法》，歷史悠久，臨床應(yīng)用廣泛，其主要成分小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿等均有良好的抗腫瘤活性，且左金丸在治療胃癌的實(shí)驗(yàn)研究方面取得了一定的研究進(jìn)展[11]。

本實(shí)驗(yàn)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)吳茱萸抗腫瘤成分和作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，結(jié)合口服利用度（OB）和類藥性（DL）篩選出吳茱萸與抗腫瘤相關(guān)的活性成分共30種。利用Cytoscape軟件構(gòu)建吳茱萸“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，揭示吳茱萸具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。分子對(duì)接結(jié)果顯示，涉及123個(gè)靶點(diǎn)，其中113個(gè)與腫瘤有關(guān)，這一結(jié)果說(shuō)明吳茱萸目前具有確切的抗腫瘤作用。結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)吳茱萸抗腫瘤靶點(diǎn)進(jìn)行分析得出吳茱萸可抑制腫瘤細(xì)胞能量代謝過(guò)程、DNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，激活或抑制與腫瘤細(xì)胞有關(guān)的30條信號(hào)通路來(lái)干預(yù)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和炎癥因子浸潤(rùn)現(xiàn)象的發(fā)生。

將交互基因進(jìn)行PPI映射并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)分析后發(fā)現(xiàn)多個(gè)與抗腫瘤緊密相關(guān)的靶點(diǎn)，其中主要作用靶點(diǎn)為MAPK14、PDE10A、ACACA、EGFR、IL1B。MAPK激酶作為多種生化信號(hào)的整合點(diǎn)，可參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等多種過(guò)程[12-14]。其可被各種環(huán)境壓力和促炎細(xì)胞因子激活。包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ATF2、MEF2C和MAX細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CDC25B和腫瘤抑制因子p53[15]，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，完成抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞的目的。PDE10A是一個(gè)已知的用于治療精神類疾病的藥物靶點(diǎn)，其可通過(guò)調(diào)節(jié)腦垂體海馬區(qū)活動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)精神性疾病，也可干預(yù)激素的分泌或激活MAPK相關(guān)通路以致腫瘤細(xì)胞快速增殖[16]。EGFR是表皮生長(zhǎng)因子受體（HER）家族成員之一，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過(guò)程發(fā)揮重要的作用，可激活MAPK加快腫瘤細(xì)胞分化。因此MAPK、EGFR和PDE10A是相互干預(yù)、協(xié)作的靶點(diǎn)[17]。ACACA是催化長(zhǎng)鏈脂肪酸生物合成中的限速反應(yīng)的一種酶，脂肪酸的合成和代謝對(duì)于細(xì)胞能量的產(chǎn)生，特別是在糖酵解活性低的腫瘤細(xì)胞中具有至關(guān)重要的作用。IL1B是一種在生理和病理狀態(tài)下均具有多重作用的多效性因子，并且通過(guò)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，可推斷為腫瘤發(fā)生進(jìn)展的一個(gè)重要靶點(diǎn)。腫瘤微環(huán)境中高濃度的IL1B可刺激腫瘤的生長(zhǎng)，且產(chǎn)生IL1B的腫瘤患者預(yù)后通常較差。

基于以上結(jié)果，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)吳茱萸抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了初步探討，吳茱萸中每個(gè)化合物可調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)可參與多個(gè)信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程，體現(xiàn)了吳茱萸多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的抗腫瘤活性。化合物-靶點(diǎn)-相關(guān)疾病網(wǎng)絡(luò)中度值較高的靶點(diǎn)，參與多個(gè)重要的信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程，為吳茱萸抗腫瘤的研究與臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步闡明中藥吳茱萸的潛在作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)和提供了新思路，但其具體作用機(jī)制并不可知，因此后期將對(duì)吳茱萸抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)研究。

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（收稿日期：2020-03-06）