DNA鳥嘌呤四聯(lián)體研究進展

馮逸龍 張文利

（南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院 南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室 江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095）

鳥嘌呤（G）四聯(lián)體，又稱作G-quadruplex或G4等，廣泛存在于生物體基因組中。它是由富含G串聯(lián)重復序列的DNA或RNA折疊形成的一種高級結構。相同或不同平面的G主要是以CGC三聯(lián)體形式，通過Hoogsteen氫鍵相互連接形成了一種更加穩(wěn)定的二級結構［1］。DNA-G4假設模型最早于1958年被提出，但直到1962年才由Gellert 等［2］通過X-Ray手段證實了該模型的真實性。由于受到當時研究手段的制約，人們對G4結構及其生物學功能認識非常有限。直到20世紀90年代，一系列用于體內外檢測G4位點的物理、生化以及免疫學等相關檢測技術的發(fā)展和應用，G4結構及其生物學功能重新引起了人們的廣泛關注。目前，人和動物G4研究已成為人類疾病治療和藥物基因組學研究的熱點之一。

目前已有的研究結果表明，生物體G4具有一系列重要的生物學功能，如穩(wěn)定染色質狀態(tài)［3-4］、參與細胞周期［5］、調節(jié)離子跨膜運輸［6］、參與表觀遺傳調控［7-11］、調控基因表達［9，12-13］以及參與DNA損傷和修復［14］等。尤為重要的是，G4現(xiàn)已作為潛在的靶標位點用于人類疾病治療［15-19］。例如，I期臨床試驗結果顯示，小分子合物CX-5461用于治療因BRCA1/2缺陷而引起的腫瘤是與它可以穩(wěn)定體內G4有關［20］。與人及動物G4研究相比，植物G4的鑒定及其生物學功能研究遠遠滯后。目前，除G4-seq被首次用于在全基因組水平鑒定擬南芥G4位點外，多數(shù)植物G4的位點還主要依賴于生物信息學方法，根據(jù)形成G4的核心序列在全基因組水平進行預測［21］，這種預測的準確性還有待于進一步驗證。

根據(jù)含有預測G4位點相關的植物基因功能聚類分析結果，植物G4也可能具有一系列重要的生物學功能，如參與基因表達調控［22］、脅迫響應［23-25］和調節(jié)植物正常生長發(fā)育［26］等。本文系統(tǒng)總結了生物體G4研究方法；重點綜述了人和動物G4的生物學功能及其最新研究進展；最后對植物G4研究進行了總結和展望。

1 G4的主要研究方法

目前，廣泛用于體內外G4研究的方法主要有:物理學、生物化學、免疫學和基因組學等。根據(jù)每次檢測G4位點數(shù)量，這些方法可分為每次檢測數(shù)量有限的低通量法和在全基因組水平進行研究的高通量法兩大類。

1.1 物理學方法

研究G4結構的物理學方法主要包括表面離子共振法（Surface plasmon resonance，SPR）、光譜檢測法以及毛細管電泳法（Capillary electrophoresis，CE）等。其中，光譜法主要有圓二色譜法（Circular dichroism，CD）、熒光光譜法（Fluorescence spectrum，F(xiàn)S）、熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）、核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）及X-射線晶體衍射（X-ray diffraction by crystals）等［27］。1962 年，Gellert 等［2］通過對DNA片段進行高溫變性后緩慢復性處理在體外重建了G4結構，并運用X-Ray的方法首次拍攝到G4四鏈結構。2002年，Cary 等［28］通過X-射線晶體衍射證實了染色體端粒的G重復序列也能形成G4結構。由于G4結構在260 nm處有一個明顯的吸收峰，Garg等［7，29］利用圓二色譜手段證實了G4廣泛存在于多種植物基因組中。熒光共振能量轉移法主要是利用具有類似激發(fā)波長的外源競爭物引起熒光標記的G4序列發(fā)生熒光偏移來鑒定G4結構。Xu等［20］通過該方法鑒定了CX-5461可作一種有前景的藥物用于癌癥的治療；2018年，Chen等［30］利用核磁共振方法證明了DEAH/RHA解旋酶DHX36通過解除G4結構參與調節(jié)基因組中G4相關的生物學功能。有報道表明，遠紅外探針方法也可用于G4結構的鑒定［31］。目前，圓二色光譜法廣泛用于驗證基因組中預測的或經(jīng)其它手段鑒定的G4位點［32］。物理學方法檢測G4具有快速準確，適用性較大等優(yōu)點；但該方法需要借助一些特殊或較昂貴的儀器設備，并且每次鑒定的G4數(shù)量有限，不適于大批量的鑒定G4位點。因此物理學方法檢測G4結構雖可行，但很難在不具備條件的實驗室或科研院所全面推廣。

1.2 生物化學方法

研究G4結構的生物化學法主要有硫酸二甲酯印跡法（Dimethylsulfate，DMS）、凝膠遷移阻滯實驗（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）和 DNA聚合酶終止法（DNA polymerase stop assay）等［33］。

DMS常與EMSA結合來檢測或驗證G4，其原理主要是對含有G4的DNA片段進行DMS甲基化處理，DMS可使非G4中的G甲基化，但G4中的G因受Hoogsteen氫鍵保護而不能被DMS甲基化，然后利用六氫吡啶對DMS處理后的寡核苷酸片段進行差異性切割，寡核苷酸片段中甲基化的鳥嘌呤受六氫吡啶特異性化學切割而發(fā)生斷裂，而六氫吡啶不能化學切割G4中未被甲基化的G，最后利用變性PAGE分離經(jīng)六氫吡啶處理后的寡核苷酸片段，根據(jù)片段大小推斷寡核苷酸片段中形成G4的位置。Armond等［34］應用該方法證實了缺氧誘導因子1R啟動子中存在G4結構。

DNA聚合酶終止法的原理:DNA聚合酶在DNA模板鏈上移動過程中，受G4結構的阻礙從模板上脫落而終止反應，導致所擴增DNA片段長短不一，然后通過PAGE電泳分離目的片段，根據(jù)片段大小推斷DNA模板中形成G4的位置。反應中加入K、Na等一價金屬陽離子及PDS或PEG等小分子化合物可穩(wěn)定G4結構，以增加反應效果［35-39］。該方法已應用于部分G4位點的鑒定和驗證［21］。凝膠遷移實驗主要運用含有G4的熒光標記的序列及探針在PAGE電泳中的遷移速度不同，進行目的片段分離，該方法常結合聚合酶終止法鑒定或驗證G4位點［40-42］。另外，G4結構的穩(wěn)定性與其loop的長度有關，正向平行及適當?shù)膌oop長度將有助于增加G4穩(wěn)定性［43］。

DMS、EMSA以及DNA聚合酶終止法有著適用性廣、結果準確、實驗周期短的優(yōu)點，可適用于多數(shù)實驗室開展G4相關研究，但每次鑒定G4位點數(shù)量有限，屬于低通量鑒定方法。

1.3 免疫學方法

檢測G4的免疫學方法主要是基于D1、1H6、hf2和BG4等特異結合G4抗體的制備及應用［5］。它主要包括免疫熒光檢測法和免疫點雜交法兩種。2013年Biffi 等［5］利用重組BG4抗體鑒定了細胞分裂時期G4位點并觀察了其分布。同樣，D1與1H6抗體也被應用于細胞水平識別G4結構［44］。例如，Henderson 等［45］通過基于1H6抗體的熒光染色方法檢測了人和小鼠細胞G4，同時證實了FANCJDNA解旋酶能夠清除基因組G4結構。hf2抗體用于檢測c-kit原癌基因啟動子區(qū)平行G4結構［46］。上述幾種抗體均有被用于檢測G4結構的報道，但是每種抗體識別細胞核內G4結構的特異性方面存在一定的差異。D1抗體對平行性G4結構具有很高的親和性，但不能用于檢測反向平行和雜合G4結構，也不能結合雙鏈DNA、隨機單鏈DNA和DNA發(fā)夾結構等［47］；1H6抗體對多數(shù)G4結構具有廣譜親和性，如對分子內或分子間G4結構均具有相似的結合力，但對分子間RNA G4結構和DNA三鏈結構親和力低，不結合由［AGGG（TTAGGG）3］序列組成的分子內G4結構，也不結合任何不能形成G4的單鏈或雙鏈DNA［45］；hf2抗體對 DNA G4結構的結合力比對雙鏈DNA的結合力強1 000倍以上，并且對兩種分子內相關的平行性G4結構的結合力相差100倍，因此該抗體對不同G4結構具有選擇性識別作用［46］；BG4抗體對分子內和分子間DNA G4結構具有高的親和力，包括平行和反平行G4等，但不結合RNA發(fā)夾結構以及單鏈或雙鏈DNA［5］。因此，可以針對每種抗體對G4結構的結合特性，選擇性研究細胞核內某一類或幾類的G4結構及其生物學功能。目前，只有BG4抗體結合高通量測序被廣泛用于全基因組水平G4的鑒定和相關生物學功能研究。其它幾種抗體能否用于在全基因組水平鑒定G4結構還有待于進一步驗證。

免疫學方法能夠識別體內生理狀態(tài)下G4位點，相對簡單易操作，也可在全基因組水平鑒定G4位點，但該方法依賴于抗體的特異性，并且不能分辨G4在基因組內分布的詳細信息，相關抗體在不同物種間的通用性還有待于進一步驗證。

1.4 G4基因組學方法

目前，在全基因組水平鑒定G4位點的高通量方法主要有ChIP-Seq和G4-Seq兩種方法。其中，G4-Seq的原理是DNA聚合酶在合成DNA新生鏈過程中，G4結構的存在可阻止聚合酶的移動并導致新合成DNA鏈中G4位點處產(chǎn)生錯配堿基，結合二代測序數(shù)據(jù)，在全基因組水平通過鑒定錯配堿基來鑒定G4位點［21］。目前，該方法已經(jīng)用于在全基因組水平鑒定了擬南芥等12個動植物G4位點，與之相類似的方法也可以用于鑒定RNA G4位點［48-49］。通過多物種比較分析發(fā)現(xiàn)，G4位點既具有一定的物種特異性，又呈現(xiàn)發(fā)育時期特異性［21，48-50］。另一類基于特異識別G4抗體的ChIP-Seq 方法也被廣泛用于全基因組水平鑒定G4。與交聯(lián)ChIP-seq方法相似，該方法主要技術流程包括:首先對受試細胞系或組織材料進行交聯(lián)處理，再將交聯(lián)染色質進行片段化處理成大小適宜的染色持片段，隨后進行基于抗體如BG4的染色質免疫共沉淀反應，最后將抗體特異結合的G4 DNA進行解交聯(lián)，純化經(jīng)抗體富集的G4 DNA用于高通量測序，經(jīng)生物信息學分析鑒定全基因組G4位點。目前該方法成功的應用于鑒定人體癌癥細胞系的G4位點［32］，發(fā)現(xiàn)G4位點具有部分調控染色質特性，如與基因組中部分開放性染色質位點（ATAC）共分布，并且G4與核小體松緊程度成正相關［51］。

G4-Seq主要利用G4空間結構所具有特性在DNA水平鑒定G4位點，因此該方法不受物種限制，適用性較廣，但該方法主要用于體外鑒定G4，不能真正反應生理狀態(tài)下的G4位點；基于G4抗體的ChIP-Seq方法具有特異性較強，可以用于體內外鑒定G4位點，但該方法易受抗體特異性影響，并且抗體在不同物種間的通用性還有待于驗證。

2 人和動物基因組中G4生物學功能

現(xiàn)階段人及動物的相關研究結果表明，G4主要影響染色質及基因組結構穩(wěn)定性、調控基因表達、調節(jié)離子跨膜運輸及參與表觀互作等方面（圖1）。

2.1 影響染色質及基因組穩(wěn)定性

端粒及著絲粒區(qū)域的富G序列能夠形成G4結構［28，52］。G4是端粒DNA中富含G序列形成的一種特殊二級結構，穩(wěn)定G4可以有效阻止端粒酶與端粒DNA相結合從而抑制端粒延伸。應用促進G4的形成或穩(wěn)定的配合體或小分子合物來抑制端粒酶活性，最終可抑制腫瘤細胞的生長和繁殖以達到抗癌目的，這是基于G4的藥物基因組學和癌癥治療的主要關注點之一。因此，端粒G4的形成和穩(wěn)定導致腫瘤細胞基因組的不穩(wěn)定性增加。另一方面，由于G4結構具有抵制外切核酸酶對端粒DNA的切割作用，從而有利于維持端粒的穩(wěn)定性。例如，酵母基因組中因缺失一種端粒加帽蛋白復合體Cdc13導致端粒不穩(wěn)定性增加，但是G4結構的存在可顯著降低這種端粒的不穩(wěn)定性［53］。另外，G4在正常的DNA雙鏈的某一條單鏈上出現(xiàn)會造成DNA鏈的斷裂，造成基因組的不穩(wěn)定［14］。總之，G4對染色質及基因組穩(wěn)定性具有雙重調節(jié)功能。

2.2 調控基因表達

G4既可以介導全基因組水平基因表達變化，也可以調節(jié)單個基因位點表達水平。轉錄組學分析結果顯示，G4穩(wěn)定性配體TMPyP4通過增加人腫瘤細胞中G4穩(wěn)定性來改變1 200個基因表達水平［54］。G4可直接參與調控基因表達。在DNA轉錄時，DNA模板鏈上G4通過阻斷RNA聚合酶移動導致轉錄停滯甚至終止，從而降低了基因的表達量［55-56］；3' UTR區(qū)G4通過阻止RNA聚合酶II移動而及時終止轉錄，防止了通讀現(xiàn)象的發(fā)生。mRNA G4可阻礙翻譯機器核糖體的結合或移動，從而降低或終止mRNA翻譯過程，導致蛋白表達量降低和基因沉默［48-49，57］。

其次，G4可通過與一些因子互作來間接調控基因表達。PPL3C等有機物質通過與c-MYC和BCL-2啟動子區(qū)G4結合，降低這兩個基因的表達量［7］；原癌基因MYC和RAS啟動子G4可顯著下調基因表達，這主要是由于G4區(qū)含有轉錄因子SP1結合位點，G4形成將不利于轉錄因子SP1的結合，從而抑制了該轉錄因子對基因表達的促進作用［58］。白屈菜赤堿通過抑制啟動子區(qū)G4的形成，降低VEGFA、BCL2和KRAS基因的表達［12］，不過串聯(lián)的G4仍然影響相關的基因表達［13］；另外，在全基因組水平，G4可通過影響其附近染色質水平變化來調節(jié)相關基因表達［52］。

最后，microRNA前體中G4結構也可間接參與調控基因表達。TmPyP4通過破壞miRNA-149前體中G4結構使癌細胞中成熟的miRNA-149濃度升高，進而降低其靶蛋白蛋白ZBTB2的表達量，最終抑制癌細胞增殖［59］。最新研究結果顯示，在染色質三維水平，G4明顯富集于拓撲關聯(lián)區(qū)（TAD），并且G4序列富集一些轉錄因子結合位點，從而暗示G4既可以調控附近基因表達也可以通過染色質成環(huán)而遠程調控相關基因表達［60］。總之，G4可直接和間接影響基因表達。目前G4對基因表達調控的研究還仍然有限，特別是G4調控基因表達的分子機理還有待于深入研究。

2.3 影響疾病發(fā)生

目前發(fā)現(xiàn)與G4有關的神經(jīng)性疾病至少有30種［61］。其中解旋酶功能缺陷相關的疾病有9種［62］，如解旋酶XPB/XPD作為TFIIH主要組成成份之一，通過與G4結合參與核酸切除修復，其功能缺陷導致色性干皮?。╔eroderma pigmentosum）；解旋酶FANCJ通過解除G4結構，它與REV1聚合酶一起參與正常的DNA復制，其功能缺陷導致范可尼貧血癥（Fanconi anemia，F(xiàn)A）；解旋酶ATRX主要參與G4區(qū)域的染色質重排［63］，其功能缺陷導致α地中海貧血伴隨智力低下癥（Alpha thalassemia with mental retardation）等。另外，人FMR1基因中CGG重復序列大量擴增超過200次，擴增后的CGG序列通過形成四聯(lián)體結構影響FMR1基因表達，從而導致脆性X染色體綜合癥（Fragile X syndrome）。同樣，位于人基因組中第9號染色體上C9ORF72位點的一個基因，其GGGGCC重復序列的大量擴增引起RNA或DNA水平G4結構形成，從而下調該基因表達，導致兩種不同的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，一種是肌萎縮側索硬化（ALS），另一種是額顳癡呆（FTD）。另外，G4也可以通過影響一些癌癥相關基因的表達，它與人類一些癌癥的發(fā)生密切相關［64-65］，但它也可以作為一種潛在的靶標位點用于腫瘤等疾病的診斷和治療，從而為治療腫瘤等疾病藥物開發(fā)提供了契機。

2.4 影響表觀修飾

人基因組研究結果顯示，與非G4序列相比，G4對應的DNA序列是低甲基化，這主要與G4結構是通過抑制DNA甲基化轉移酶1（DNMT1）結合或向G4周圍序列擴散有關［10］。在染色質水平，G4可以作為基因組中表觀調控的靶標位點，說明G4可影響對其附近的染色質水平的表觀修飾。例如a-球蛋白基因的數(shù)量可變串聯(lián)重復區(qū)（VNTR）富含易形成G4結構的G堿基序列，SWI/SNF染色質重塑家庭的成員的ATRX可特異結合該G4序列，進而招募有利于基因表達的激活性染色質修飾，從而促進a-球蛋白基因的表達［63］。另外，G4可以作為表觀遺傳調控元件影響基因啟動子區(qū)附近的組蛋白修飾［66］。這樣，G4可以直接或間接影響局部DNA或染色質等表觀修飾。

R-Loop即DNA單鏈及其對應的DNA和RNA雜合鏈形成的一種三鏈結構，它普遍于生物體基因組中。已有的研究結果表明，人和植物基因組中存在R-Loop和G4共分布現(xiàn)象［8，67］?；騿幼訁^(qū)域R-Loop和G4共存顯著抑制基因的轉錄，消除R-loop可降低這種抑制作用，從而說明R-loop可增強G4的作用［8］。在細胞分裂S期時，R-Loop可通過促進G4的形成來抑制基因表達［68］；另外，G4通過穩(wěn)定R-Loop結構參與DNA損傷修復［69］。不過，R-loop與G4間相互作用的模式或機制目前仍不是十分清楚。此外，G4結構也可能參與人體細胞的離子跨膜運輸過程［6］，DNA復制［70］、免疫球蛋白類別轉換和B細胞高頻突變［71］等重要的生物學過程。

圖1 G4在人和植物中的主要生物學功能

3 植物G4生物學功能

與人、動物和酵母等基因組中G4研究相比，植物G4研究遠遠滯后。植物G4研究主要集中在基于生物信息學的預測分析上［72］。目前，利用生物信息手段預測了水稻、玉米和擬南芥等16種已測序的單雙子葉植物基因組中G4位點，并且利用CD和DNA聚合酶終止實驗，在體外初步驗證了水稻和擬南芥等4種植物基因組中部分G4序列［73-74］。另外，利用生物信息手段構建了196種植物的G4數(shù)據(jù)庫，從而方便查詢相關植物基因組中可能存在的G4位點［72］。序列分析結果顯示，基因組中 G4的loop長度具有一定亞基因組分布傾向性，如G3L1-3和G3L1-7的G4結構傾向于富集在啟動子區(qū)。通過對單雙子葉植物基因組中含有G4序列的直系同源基因進行功能聚類分析，發(fā)現(xiàn)相關基因主要參與了基因表達調控、生殖發(fā)育、離子等跨膜運輸、能量代謝以及體內外脅迫響應等生物學過程［73-74］，說明G4同樣參與了植物一些基本生物學過程。Marsico等［21］利用G4-seq在全基因組水平鑒定了擬南芥G4位點，并對其序列特征進行了初步分析，但并未涉及G4相關的生物學功能研究。因此，植物基因組中DNA G4的生物學功能以及相關的作用機制研究還有待于深入開展。

同樣，RNA G4具有調控植物基因表達和正常生長發(fā)育等生物學功能。例如，SMXL4/5基因mRNA未形成G4時，SMXL4/5蛋白能夠正常表達參與了韌皮部細胞的分化與生長，其mRNA G4可抑制該基因表達并影響韌皮部細胞的分化［26］。

SHR mRNA及其突變體相關的研究表明，SHR mRNA G4結構能夠調節(jié)植物根細胞液-液分離［75］，說明RNA G4可能在植物生理調節(jié)方面起到了重要的作用。光對G4結構的建成與消失具有一定的催化作用，推測G4也可能參與了植物光合作用，但需要進一步研究提供相關證據(jù)［76-77］。與動物不同，目前未發(fā)現(xiàn)植物microRNA前體上的G4具有調控其靶基因表達的作用［78］。

4 總結與展望

G4是普遍存在于生物體基因組中一種高級結構。它廣泛參與了動植物體生長發(fā)育、基因組結構穩(wěn)定性、基因表達調控和DNA損傷及修復等一系列重要的生物學過程。隨著全基因組水平鑒定G4方法的發(fā)展和應用，將大力推進動植物體G4生物學功能研究。特別是G4在動植物體作用的分子機制還有待于深入研究，例如，G4是如何通過招募或排斥一些反式作用因子來實現(xiàn)其生物學功能；G4是如何通過影響表觀修飾或與表觀修飾因子互作來參與一些生物學過程的調控等。

深入解析G4對人類疾病發(fā)生的機制將有助于加深人們對癌癥發(fā)病機理的認識。目前，G4作為靶標位點用于抗癌藥物設計［79］，癌癥和神經(jīng)性疾病的診斷和治療［16-18］，從而加速了現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展。例如，肝癌細胞中G4分布增加，因此 G4可用于肝癌早期輔助診斷［64］。G4作為潛在的藥物靶標用于治療精神類疾病等［19］。

同樣，闡明植物G4生物學功能及其作用機制，將為基于基因表達調控的作物表觀遺傳育種提供理論參考。逆境脅迫特異的G4可作為分子標記用于作物抗逆分子育種，加速其育種進程?？傊?，隨著研究的深入，G4在人類疾病診斷和治療，農(nóng)用物分子育種等方面將具有更加廣闊的應用前景。