用于Escherichia coli O157∶H7直接快速檢測的倏逝波熒光核酸適配體傳感器研究

方順燕 宋丹 劉艷萍 徐文娟 劉佳瑤 韓向峙 龍峰

（中國人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100872）

病原菌引起的各種傳染病是當(dāng)今危害人類健康與生命安全最為嚴(yán)重的一類疾?。?-2］。病原菌傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測法是一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)方法，但檢測周期長、程序復(fù)雜［1-3］。同時(shí)，由于病原菌種類日益增多，且不少病原菌尚無可行的分離培養(yǎng)方法。而對(duì)于臨床檢驗(yàn)和環(huán)境污染應(yīng)急檢測來說，最為關(guān)鍵的要求之一是盡可能簡化分析處理過程、盡快獲得檢測結(jié)果和減少所需樣品量。傳統(tǒng)培養(yǎng)法顯然難以這樣要求。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)的飛速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)及免疫分析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測，如PCR技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)等。理論上，這些方法可以檢測幾乎所有病原菌，并且可有效提高病原菌檢測的時(shí)效性及靈敏度，但是這些分析技術(shù)仍然需要較長時(shí)間（＞2 h）、前處理過程繁雜、易受雜質(zhì)干擾、所需的樣品量較大及存在假陽/陰性結(jié)果等不足之處［1-4］。因此，發(fā)展適用于病原菌現(xiàn)場即時(shí)高靈敏、高特異性及快速經(jīng)濟(jì)的新技術(shù)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)和前沿［5］。

在融合現(xiàn)代光學(xué)、分子生物學(xué)和微流控等優(yōu)勢技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來光學(xué)生物傳感技術(shù)是病原菌現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域最為耀眼的明珠［5］。光學(xué)生物傳感器可大致分為比色生物傳感器、基于表面等離子共振的生物傳感器和基于激光誘導(dǎo)熒光的生物傳感器。其中，基于激光誘導(dǎo)熒光的生物傳感器已成為研究最為深入和應(yīng)用最為廣泛的一種光學(xué)生物傳感器。基于夾心法原理，利用納米信號(hào)增強(qiáng)技術(shù)，該類傳感器檢測細(xì)菌和病毒污染的靈敏度可達(dá)到10 CFU/mL［5-6］。但要實(shí)現(xiàn)光學(xué)生物傳感器真正的實(shí)用化還存在幾大挑戰(zhàn)。第一個(gè)挑戰(zhàn)是使用現(xiàn)有的生物傳感器要實(shí)現(xiàn)病原菌檢測的關(guān)鍵步驟需將生物識(shí)別分子（如抗體、核酸適體等）固定到傳感元件上，以實(shí)現(xiàn)病原菌的特異性識(shí)別和捕獲。但修飾過程會(huì)造成生物分子活性的降低，且由于位阻效應(yīng)，生物分子的固定會(huì)影響其對(duì)病原菌的捕獲，從而影響檢測靈敏度［7］。另一方面，生物傳感器的優(yōu)勢在于其可重復(fù)使用，但當(dāng)固定抗體或核酸適配體等生物識(shí)別分子時(shí)，由于再生條件（強(qiáng)酸或強(qiáng)堿）苛刻，使得生物分子的活性快速下降，導(dǎo)致生物傳感器再生次數(shù)非常有限（＜10次）。第二個(gè)挑戰(zhàn)是如何簡化病原菌檢測方式以實(shí)現(xiàn)其現(xiàn)場快速分析?，F(xiàn)有的病原菌生物傳感器一般采用夾心法，這就使得檢測過程需要進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)步驟，增加了檢測時(shí)間。同時(shí)，使用試劑種類多，造成檢測成本比較高。更為重要的是，為提高檢測靈敏度，通常需要使用過濾或免疫磁珠來對(duì)病原菌進(jìn)行富集分離，這進(jìn)一步延長了檢測時(shí)間并使得檢測過程復(fù)雜化。

為此，本研究提出一種新的倏逝波熒光生物傳感分析策略來實(shí)現(xiàn)病原菌直接快速檢測。根據(jù)我們前期的研究成果和經(jīng)驗(yàn)，倏逝波光纖生物傳感器是利用光在光纖進(jìn)行全反射傳播時(shí)，在光纖表面產(chǎn)生倏逝波，其強(qiáng)度隨滲入深度呈指數(shù)衰減，有效深度在100 nm以內(nèi)，當(dāng)熒光標(biāo)記的生物分子探針進(jìn)入倏逝波有效范圍內(nèi)，熒光分子被激發(fā)光激發(fā)發(fā)出熒光，通過檢測熒光強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測［8-9］。而病原菌（如大腸桿菌、沙門氏菌等）的尺寸約為幾百nm到μm級(jí)。因此，我們提出基于倏逝波熒光原理及其與病原菌的尺寸效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)病原菌的直接快速檢測。本研究以E.coliO157∶H7為靶標(biāo)物，結(jié)合特異性的核酸適配體來實(shí)現(xiàn)其直接快速檢測?；驹硎钱?dāng)一定濃度熒光標(biāo)記核酸適配體加入樣品檢測池時(shí)，倏逝波激發(fā)熒光分子發(fā)出熒光，利用課題組前期研發(fā)的倏逝波全光纖生物傳感器即可實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的定量檢測。而當(dāng)熒光標(biāo)記的核酸適配體與E.coliO157∶H7混合后加入樣品檢測池，由于部分核酸適配體結(jié)合到E.coliO157∶H7表面，其標(biāo)記熒光分子不能被激發(fā)，故導(dǎo)致檢測熒光信號(hào)降低，利用熒光信號(hào)強(qiáng)度與E.coliO157∶H7濃度的比例關(guān)系即可實(shí)現(xiàn)其定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑、緩沖溶液及適配體等 濃硫酸、過氧化氫、氫氟酸、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉及鹽酸等化學(xué)試劑均購于北京化學(xué)試劑公司，所有試劑均為分析純或更高。十二烷基硫酸鈉（SDS）購自Sigma-aldrich公司（上海，中國）。自配PBS緩沖溶液（pH 7.4，137 mmol/L NaCl+2.7 mmol/L KCl+4.3 mmol/L Na2HPO4+1.4 mmol/L KH2PO4）、Tris-HCl緩沖液、SDS溶液（0.5% SDS，pH 1.9）。

與大腸桿菌特異性結(jié)合的核酸適配體序列結(jié)構(gòu)為5'- GCGGGAATAGGATGCGGCTGG AAGGAGAGGTGTTGGTGGGTGGTG -3'，其5'-端標(biāo)記熒光分子Cy5.5，該核酸適配體由生工生物工程（上海）股份公司合成。E.coliO157∶H7、發(fā)光細(xì)菌、沙門氏菌使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。不同濃度的菌液由10 mmol/L PBS溶液稀釋而成。

1.1.2 倏逝波熒光光纖生物傳感器 使用的倏逝波熒光光纖生物傳感器如圖1所示。其原理是，激發(fā)光（635 nm，10 mW）經(jīng)過單多模光纖耦合器進(jìn)入光纖傳感探頭，在光纖傳感探頭內(nèi)以全反射方式傳播，并在探頭表面形成倏逝波。當(dāng)熒光分子進(jìn)入倏逝波激發(fā)的有效范圍內(nèi)時(shí)，倏逝波激發(fā)熒光分子發(fā)出熒光，部分熒光耦合回光纖傳感探頭，由單多模光纖耦合器進(jìn)行收集與傳輸，經(jīng)濾光片濾除雜散光后被硅光電探測器進(jìn)行檢測。檢測到的熒光信號(hào)值實(shí)時(shí)顯示在用戶界面上。

圖1 倏逝波熒光光纖生物傳感器原理示意圖

1.2 方法

1.2.1 光纖傳感探頭制備 將 5.5 cm長的石英光纖（數(shù)值孔徑為0.22，南京春暉科技發(fā)展有限公司）去除2.5 cm長的涂覆層，將無涂覆層的光纖浸入50%HF溶液中進(jìn)行腐蝕，光纖芯徑腐蝕至225 μm即可。

1.2.2 病原菌的培養(yǎng)E.coliO157∶H7的菌落用灼燒后冷卻的接種環(huán)接種于1 mL LB液體培養(yǎng)基中，將其在置于37℃恒溫水浴震蕩12 h，然后將震蕩好的菌液加入到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃水浴恒溫震蕩24 h。為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每次實(shí)驗(yàn)均使用新鮮菌液。

1.2.3E.coliO157∶H7的檢測 為獲得E.coliO157∶H7檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，將500 nmol/L的E.coliO157∶H7核酸適體分別與不同濃度的E.coliO157∶H7混合，在25℃下預(yù)反應(yīng)15 min，然后輸入到樣品檢測池進(jìn)行熒光信號(hào)檢測。每個(gè)濃度進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)不同濃度E.coliO157∶H7所得到熒光信號(hào)檢測值進(jìn)行歸一化處理，即:

式中，I為加入不同濃度的E.coliO157∶H7時(shí)，傳感器檢測到的熒光信號(hào)值；I0為未加E.coliO157∶H7的空白樣品熒光信號(hào)值。利用Logistics四參數(shù)模型進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，即:

式中，［x］為E.coliO157∶H7的濃度；y為x對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)歸一化值；A1為上端漸近線（x=0），常數(shù)；A2為下端漸近線（x→∞），常數(shù)；［x0］為曲線的拐點(diǎn)，常數(shù)；p為拐點(diǎn)處曲線的斜率，常數(shù)。根據(jù)Sinibaldi等［10］和 Chiavaioli等［11］，傳感器的檢測限一般定義為空白樣檢測的平均信號(hào)值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，依據(jù)該定義對(duì)該傳感器的檢測限進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 實(shí)際水樣的加標(biāo)檢測 以校園景觀水、自來水、污水處理廠出水為例進(jìn)行加標(biāo)分析，考察水體基質(zhì)對(duì)傳感分析性能的影響。由于實(shí)際樣品中所含細(xì)菌種類多樣，如果不進(jìn)行滅菌操作，實(shí)驗(yàn)樣品的各種細(xì)菌均可在LB培養(yǎng)基上生長，導(dǎo)致無法使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行比對(duì)。因此，首先運(yùn)用高溫滅菌鍋對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行高溫滅菌（121℃），以便考察實(shí)際樣品對(duì)傳感器的影響并于傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行比對(duì)。然后，將擴(kuò)增培養(yǎng)的菌液使用離心機(jī)在10 000 r/min下離心8 min，清洗3次后，加入各種實(shí)際水樣中，并配成3種不同濃度。各種加標(biāo)水樣與500 nmol/L熒光標(biāo)記E.coliO157∶H7核酸適配體混合，在25℃下預(yù)反應(yīng)15 min，然后輸入樣品檢測池進(jìn)行檢測。微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)法將各種加標(biāo)水樣分別稀釋后，取100 μL稀釋液在LB固體培養(yǎng)基上涂布，在37℃恒溫培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 基于倏逝波熒光原理的E.coli O157∶H7傳感分析機(jī)制與驗(yàn)證

基于倏逝波熒光原理的E.coliO157∶H7傳感分析機(jī)制如圖2所示。由菲涅爾公式可知，當(dāng)光束由折射率n大的介質(zhì)進(jìn)入n小的介質(zhì)時(shí)，若入射角θ大于臨界角θc，入射光將全部反射回n大的介質(zhì)中。在全反射的條件下，由于橫向電場與橫向磁場的Fresnel傳遞系數(shù)不為零，這意味著雖然光能全部被反射，但電磁場卻可從兩種介質(zhì)的界面延伸至n小的介質(zhì)中，即所謂的“倏逝波”，并遵循式（3）呈指數(shù)衰減［12］:

式中，z為距光纖探頭界面的距離，E（z）為z處倏逝波振幅，E0為界面處電磁場振幅，dp為滲入深度。對(duì)于多模光纖探頭，滲入深度dp（定義為電磁場為界面處電磁強(qiáng)度1/e的距離），為折射率、入射角和波長的函數(shù):

式中:λex是激發(fā)光的波長；θ是激發(fā)光與法線間夾角。本試驗(yàn)中激發(fā)光波長為635 nm，光纖探頭折射率為1.456，PBS溶液的折射率為1.33，因此，倏逝波的有效深度約為100 nm。

當(dāng)500 nmol/L熒光標(biāo)記核酸適配體輸入到樣品檢測池時(shí)，從圖3可以看出，倏逝波熒光光纖生物傳感器檢測到突然上升的熒光信號(hào)，這是由于倏逝波激發(fā)溶液中游離的核酸適配體標(biāo)記熒光所致。由于倏逝波的強(qiáng)度有限，熒光漂白不明顯，因此傳感器檢測熒光信號(hào)值保持基本不變。當(dāng)500 nmol/L熒光標(biāo)記核酸適配體與1×105CFU/mL大腸桿菌混合反應(yīng)一段時(shí)間后輸入到樣品檢測池時(shí)，傳感器檢測到熒光信號(hào)也突然上升，但是熒光信號(hào)值明顯低于未加入大腸桿菌時(shí)的熒光信號(hào)值。這說明部分核酸適配體特異性結(jié)合到大腸桿菌表面，由于大腸桿菌的尺寸在微米級(jí)，倏逝波很難激發(fā)結(jié)合到大腸桿菌表面的熒光標(biāo)記核酸適配體，從而導(dǎo)致檢測到的熒光信號(hào)值下降。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論，我們將500 nmol/L熒光標(biāo)記的大腸桿菌核酸適配體分別與1×109CFU/mL沙門氏菌和發(fā)光細(xì)菌混合并輸入到樣品檢測池，從圖3可以看出，雖然沙門氏菌和發(fā)光細(xì)菌的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大腸桿菌的濃度，但是傳感器檢測到的熒光信號(hào)值并沒有明顯下降。這一方面說明大腸桿菌核酸適配體具有良好的選擇性，不會(huì)與其他病原菌結(jié)合，同時(shí)證明本研究提出的基于倏逝波熒光原理和及其與病原菌尺寸效應(yīng)的檢測機(jī)制是可行的，可以用于E.coliO157∶H7的直接快速檢測。

圖2 基于倏逝波熒光原理的E.coli O157∶H7傳感分析機(jī)制示意圖

圖3 E.coli O157∶H7傳感分析驗(yàn)證

2.2 E.coli O157∶H7檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

為獲得基于倏逝波熒光原理的E.coliO157∶H7生物傳感分析標(biāo)準(zhǔn)檢測曲線，配制不同濃度的E.coliO157∶H7溶液，分別與500 nmol/L的熒光標(biāo)記核酸適配體混合，反應(yīng)15 min后輸入到樣品檢測池進(jìn)行熒光信號(hào)值檢測，得到系列熒光信號(hào)檢測曲線（圖4）。從圖4可以看出，倏逝波熒光光纖傳感器檢測到的熒光信號(hào)值隨E.coliO157∶H7濃度的升高而下降。這是由于隨著E.coliO157∶H7濃度的增加，更多的熒光標(biāo)記核酸適配體結(jié)合E.coliO157∶H7表面。因E.coliO157∶H7的尺寸在微米級(jí)，而倏逝波的滲入深度有限，部分標(biāo)記在核酸適配體上熒光分子不能被激發(fā)，從而導(dǎo)致熒光信號(hào)值的下降。各個(gè)濃度E.coliO157∶H7重復(fù)測試3次，熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差都少于5%，表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

圖4 不同濃度E.coli O157∶H7的典型熒光信號(hào)曲線

將不同濃度下的熒光信號(hào)值根據(jù)式1進(jìn)行歸一化處理，所得歸一化值按式2擬合，得到E.coliO157∶H7的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）。通過計(jì)算可以得出，E.coliO157∶H7檢測范圍為1.1×103-1.4×107CFU/mL，檢測限［10-11］為610 CFU/mL。以上結(jié)果表明該方法具有較好的靈敏度和穩(wěn)定性。

2.3 實(shí)際水樣的E.coli O157∶H7加標(biāo)測試

圖5 E.coli O157∶H7檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

為驗(yàn)證該方法在實(shí)際水樣中運(yùn)用的可行性，考察水體基質(zhì)對(duì)傳感分析性能的影響，利用該方法分析了校園景觀水、自來水和污水處理廠出水等實(shí)際水樣的加標(biāo)回收率并與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行了比對(duì)。在檢測前，先用高溫滅菌鍋對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行高溫滅菌（121℃）。然后，將培養(yǎng)的E.coliO157∶H7加入各種實(shí)際水樣中。各種加標(biāo)水樣與500 nmol/L熒光標(biāo)記E.coliO157∶H7核酸適配體混合，在25℃下預(yù)反應(yīng)15 min，然后輸入樣品檢測池進(jìn)行檢測。從表1可以看出，E.coliO157∶H7的回收率在40%-180%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%之內(nèi)。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法具有較好的一致性，這些結(jié)果表明本研究建立的基于倏逝波熒光原理的E.coliO157∶H7生物傳感分析方法可以用于實(shí)際水樣的檢測。

3 討論

E.coliO157∶H7是一種腸出血性大腸桿菌，可經(jīng)食物和飲用水在人群中廣泛傳播，可導(dǎo)致腹痛、腹瀉、急性腎衰，甚至死亡。美國和歐盟曾發(fā)生多次E.coliO157∶H7的爆發(fā)性流行［13］。因此，多國衛(wèi)生部門已將E.coliO157∶H7列為常規(guī)檢測項(xiàng)目，我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中要求不得檢出［14-15］。因此，發(fā)展高特異性、操作簡單、檢測迅速及成本低廉的病原菌檢測方法具有重要的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

本研究結(jié)合倏逝波熒光光纖傳感器和核酸適配體的優(yōu)勢，提出了基于倏逝波熒光原理及其與病原菌尺寸效應(yīng)的E.coliO157∶H7直接快速檢測方法。該方法可以避免傳統(tǒng)生物傳感器需要固定生物識(shí)別分子造成的諸多不足，如生物識(shí)別分子在固定過程中可能導(dǎo)致活性損失等。由于本研究采用的是將特異性核酸適配體與E.coliO157∶H7在均相中直接反應(yīng)，因此，可以有效提高生物識(shí)別分子與病原菌的親和反應(yīng)效率。這種檢測模式無需苛刻的再生條件，僅需在檢測完成后，將樣品排出樣品池即可進(jìn)行下一個(gè)樣品的檢測。同時(shí)，傳統(tǒng)生物傳感器常采用夾心法方式來實(shí)現(xiàn)病原菌的檢測，即采用一種生物識(shí)別分子（抗體或核酸適配體等）固定在生物傳感器表面捕獲病原菌，然后用另一種熒光標(biāo)記生物功能分子結(jié)合到病原菌表面作為報(bào)告分子［16-19］。本研究提出的方法僅用一種熒光標(biāo)記核酸適配體即可實(shí)現(xiàn)E.coliO157∶H7快速識(shí)別與定量檢測，這可以大大簡化病原菌檢測程序，減少檢測時(shí)間和反應(yīng)試劑的使用，有效降低檢測成本。更進(jìn)一步，本研究提出的檢測方法僅需更換熒光標(biāo)記的生物識(shí)別分子即可實(shí)現(xiàn)其他不同的病原菌的檢測。因此，基于倏逝波熒光原理及其與病原菌尺寸效應(yīng)的生物傳感分析技術(shù)具有廣泛的適用性和實(shí)用性。

表1 實(shí)際水樣中E.coli O157∶H7的加標(biāo)回收率（n=3）

4 結(jié)論

融合倏逝波熒光光纖傳感器和特異性核酸適配體的優(yōu)勢，提出一種了基于倏逝波熒光原理及其與病原菌尺寸效應(yīng)的病原菌新型檢測方法。研究表明該方法可實(shí)現(xiàn)E.coliO157∶H7的直接快速檢測，檢測限可達(dá)610 CFU/mL，線性檢測區(qū)間為1.1×103-1.4×107CFU/mL。由于使用特異性核酸適配體與E.coliO157∶H7在均相溶液中結(jié)合，利用倏逝波熒光原理及尺寸效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)其快速檢測，無需固定生物識(shí)別分子，也無需采用夾心法的檢測模式。因此，該方法可有效縮短檢測時(shí)間（＜30 min），減少使用的反應(yīng)試劑和檢測成本。對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明加標(biāo)回收率在40%-180%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%之內(nèi)，水樣基質(zhì)對(duì)該方法檢測E.coliO157∶H7沒有明顯影響。因此，本研究建立基于倏逝波熒光原理及其與病原菌尺寸效應(yīng)的生物傳感分析方法可以用于實(shí)際水樣的檢測，同時(shí)，僅需更換熒光標(biāo)記的生物識(shí)別分子即可實(shí)現(xiàn)其他不同的病原菌的檢測。