膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞STAT3 mRNA表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

謝璨燦，曾維忠，吳雙華，李崢嶸，黃冰

株洲中心醫(yī)院，湖南株洲412007

膿毒癥是一種由細(xì)菌或真菌進(jìn)入血液感染人體免疫系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)而引起的致死性綜合征。多種炎癥因子在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)下，通過(guò)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的級(jí)聯(lián)式或瀑布式效應(yīng)，從而加速中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，激活凝血系統(tǒng)，最終發(fā)展為膿毒癥[1～3]。膿毒癥患者一旦出現(xiàn)膿毒癥休克，病死率明顯增加[4,5]。尋找特異度和敏感度更高的生物標(biāo)志物作為膿毒癥的早期診斷指標(biāo)一直是學(xué)者們研究的重點(diǎn)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)可能是膿毒癥所致功能障礙的關(guān)鍵調(diào)控基因[6]。近年來(lái)，有關(guān)STAT3參與膿毒癥機(jī)制的研究取得了一定進(jìn)展[7]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在膿毒癥中異常表達(dá)，其不僅可以直接調(diào)控促炎因子和抑炎因子的表達(dá)釋放，還可作用于炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路的其他關(guān)鍵分子間接調(diào)控膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。STAT1和STAT3有望作為預(yù)測(cè)膿毒癥合并多器官功能障礙的新標(biāo)志物[8～10]。急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分Ⅱ(APACHEⅡ)是臨床上最權(quán)威的危重癥病情評(píng)估系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于危重癥患者病情嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)[11]。本研究觀察了膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中STAT3 mRNA的表達(dá)變化，探討其與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，進(jìn)一步分析STAT3 mRNA對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年1～11月株洲市中心醫(yī)院收治的膿毒癥患者92例(膿毒癥組，男62例、女30例)以及同期入院體檢的健康志愿者20例(對(duì)照組，男10例、女10例)作為研究對(duì)象。兩組性別、年齡資料有可比性。膿毒癥診斷符合2016年美國(guó)重癥醫(yī)學(xué)會(huì)和歐洲危重病醫(yī)學(xué)會(huì)聯(lián)合發(fā)布的最新膿毒癥定義SEPSIS3.0中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除住院時(shí)間少于24 h者，惡性腫瘤、先天性或繼發(fā)性免疫功能缺陷性疾病患者，病歷資料記錄不完整者。膿毒癥組入院時(shí)進(jìn)行APACHEⅡ評(píng)分>30分(高危)26例、20～30分(中危)48例、10～<20分(低危)18例；28 d內(nèi)存活50例、死亡42例，存活者、死亡者入院時(shí)血清降鈣素原(PCT)水平分別為(31.82±41.08)、(37.15±38.25)ng/mL，血乳酸(Lac)水平分別為(2.84±2.27)、(6.26±4.74)mmol/L。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，研究方案獲得患者或家屬知情同意。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞STAT3 mRNA檢測(cè) 膿毒癥組于確診6 h內(nèi)、對(duì)照組于同時(shí)取靜脈血10 mL，加入EDTA抗凝管，使用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入RNA穩(wěn)定劑中保存，置于-70 ℃冰箱保存待檢。以TRIzol法常規(guī)提取淋巴細(xì)胞總RNA，取少量RNA溶液，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)波長(zhǎng)260、280 nm的吸光度(A)值，以A260/A280≥1.8為合格樣品，獲取RNA濃度值。采用TaKaRa PrimScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)GenBank提供的GAPDH及STAT3基因序列，采用Pmerremier5.0軟件設(shè)計(jì)人源引物。內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-GATTTGGTCGTATTGGGCGC-3′，下游引物序列為5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。STAT3 mRNA上游引物序列為5′-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3′，下游引物序列為5′-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3′。按照SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明書上實(shí)時(shí)定量PCR儀(AB7500)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥組外周血單個(gè)核細(xì)胞中STAT3 mRNA表達(dá)變化 膿毒癥組、對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.93±0.30、1.00±0.14，膿毒癥組STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.01)。膿毒癥組中，低危、中危、高?；颊逽TAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.77±0.27、1.93±0.27、2.17±0.22，低危、中危、高?；颊逽TAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，兩兩相比，P均<0.05；存活、死亡患者STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.80±0.22、2.09±0.30，死亡患者STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于存活者(P<0.01)。

2.2 膿毒癥組STAT3 mRNA表達(dá)與APACHEⅡ評(píng)分、PCT、Lac的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，膿毒癥組外周血單個(gè)核細(xì)胞STAT3 mRNA表達(dá)水平與APACHEⅡ評(píng)分、Lac呈正相關(guān)(r分別為0.719、0.332，P均<0.05)，與PCT無(wú)關(guān)(r=-0.097，P>0.05)。

2.3 STAT3 mRNA、APACHEⅡ評(píng)分、PCT、Lac對(duì)膿毒癥患者死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值 外周血單個(gè)核細(xì)胞STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡的ROC曲線下面積(AUC)為0.892(P<0.01)，最佳截?cái)嘀禐?.06時(shí)敏感度為81%、特異度為88%；APACHEⅡ評(píng)分預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡的ROC曲線下面積(AUC)為0.890(P<0.01)，最佳截?cái)嘀禐?4.5分時(shí)敏感度為81%、特異度為86%；而Lac、PCT等指標(biāo)相較于前兩者預(yù)測(cè)價(jià)值較小。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 STAT3 mRNA、APACHEⅡ評(píng)分、PCT、Lac預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡的ROC曲線

3 討論

膿毒癥的病理生理機(jī)制極其復(fù)雜，涉及一系列的炎癥與抗炎過(guò)程、體液與細(xì)胞反應(yīng)，以及循環(huán)系統(tǒng)的異常等。目前膿毒癥的治療主要采用早期液體復(fù)蘇、使用血管活性藥物維持血壓以保證組織灌注、改善微循環(huán)、使用強(qiáng)效抗生素、使用激素增強(qiáng)血管活性藥物敏感性、床旁血液凈化等，如果不能糾正患者低灌注狀態(tài)，則可能發(fā)生膿毒癥休克，患者可出現(xiàn)高熱、凝血功能異常、多器官功能衰竭甚至死亡。雖然近年來(lái)膿毒癥休克的治療流程和手段更加規(guī)范，患者病死率有所降低，但膿毒癥的早期診治仍有局限性，使得該病的治療依然面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

STAT3是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控炎癥的主要信號(hào)通路，在膿毒癥中起重要作用[12]。在膿毒癥早期，大量促炎因子如IL-6、TNF-α通過(guò)STAT3通路引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)[13]。而有研究表明，感染性休克時(shí)血清IL-6水平持續(xù)升高，患者死亡率也會(huì)隨之上升[14]。血漿IL-6和TNF-α水平均很高的敗血癥患者一般預(yù)后不良。Kamezaki等[15]發(fā)現(xiàn)LPS通過(guò)Tyk2進(jìn)而激活STAT1和STAT3信號(hào)通路，引起炎癥因子大量釋放，進(jìn)而促發(fā)感染性休克。Herzig等[16]發(fā)現(xiàn)STAT3活化是CLP誘導(dǎo)感染性休克進(jìn)程中的關(guān)鍵，并且與炎癥介質(zhì)的釋放和器官功能障礙密切相關(guān)。Zhao等[17，18]發(fā)現(xiàn)STAT3抑制劑LL2可以抑制膿毒癥早期促炎因子表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，表明STAT3信號(hào)通路激活參與膿毒癥引起的炎癥反應(yīng)，而抑制通路活性可減輕炎癥反應(yīng)。有研究表明，STAT3的激活能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)性降低，這可能與膿毒癥的免疫抑制機(jī)制存在關(guān)聯(lián)。因此，靶向調(diào)控STAT3的表達(dá)為干預(yù)膿毒癥提供了一個(gè)新的方向[19]。

表1 STAT3 mRNA、APACHEⅡ評(píng)分、PCT、Lac對(duì)膿毒癥患者死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值

APACHEⅡ評(píng)分是目前國(guó)內(nèi)外較為認(rèn)可的危重癥病情評(píng)價(jià)系統(tǒng)，它是針對(duì)患者急性生理和慢性健康狀況的綜合評(píng)價(jià)體系，其分值越高表明患者的狀態(tài)越差，死亡的可能性越大。APACHEⅡ評(píng)分能夠較為全面地反映患者機(jī)體狀況和評(píng)估危重患者預(yù)后[20]。膿毒癥涉及的生物標(biāo)志物種類繁多。有學(xué)者[21]估算文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)膿毒癥的生物標(biāo)志物超過(guò)178種，目前應(yīng)用最廣泛的為PCT。膿毒癥經(jīng)目標(biāo)導(dǎo)向治療后，PCT值下降通常提示患者預(yù)后改善，如果PCT值維持原水平或較前升高則提示患者預(yù)后不佳。PCT對(duì)膿毒癥預(yù)后的判斷具有一定的參考價(jià)值[22]。血清Lac檢測(cè)通常被納入危重疾病的臨床管理，特別是在嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克的情況下。血清Lac水平升高被認(rèn)為是組織缺氧的標(biāo)志，通常在臨床上用作評(píng)價(jià)膿毒癥嚴(yán)重程度和預(yù)后的指標(biāo)。高濃度的血清Lac可能是患者死亡的預(yù)測(cè)指標(biāo)，而Lac水平降低與預(yù)后改善有關(guān)[4,23,24]。

本研究觀察了膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中STAT3 mRNA表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥組STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組；膿毒癥組中，低危、中危、高危患者STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，死亡患者STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于存活者；膿毒癥組外周血單個(gè)核細(xì)胞STAT3 mRNA表達(dá)水平與APACHEⅡ評(píng)分、Lac呈正相關(guān)，與PCT無(wú)關(guān)。這表明膿毒癥患者STAT3 mRNA表達(dá)水平升高，且可能與患者的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān)，STAT3表達(dá)水平高的膿毒癥患者預(yù)后較差，死亡風(fēng)險(xiǎn)較高。進(jìn)一步分析STAT3 mRNA及其他常用指標(biāo)對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，外周血單個(gè)核細(xì)胞STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡的AUC為0.892，最佳截?cái)嘀禐?.06時(shí)敏感度為81%、特異度為88%；APACHEⅡ評(píng)分預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡的AUC為0.890，最佳截?cái)嘀禐?4.5分時(shí)敏感度為81%、特異度為86%。這表明STAT3 mRNA相對(duì)于其他指標(biāo)對(duì)膿毒癥患者死亡有更好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，與患者APACHEⅡ評(píng)分及28 d內(nèi)預(yù)后有關(guān)；檢測(cè)膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的STAT3 mRNA有助于反映疾病嚴(yán)重程度并預(yù)測(cè)預(yù)后。STAT3有望成為膿毒癥早期診斷和治療評(píng)估的關(guān)鍵性指標(biāo)。然而本研究尚存在一定局限性，由于膿毒癥休克患者病情危重，未能收集更多樣本信息，之后研究應(yīng)納入更多患者，以驗(yàn)證上述結(jié)論。