干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建和鑒定

許向陽，裴 童，吳泰茹，王子玉，趙婷婷，李景富，楊歡歡，張 賀，姜景彬

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

番茄（Solanum lycopersicum）在生長發(fā)育過程中面臨許多不利環(huán)境因素，如非生物脅迫。在非生物脅迫中，干旱脅迫是造成番茄經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的脅迫之一，對番茄植株水分代謝途徑與干旱逆境應(yīng)答信號傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生顯著影響[1]。例如，干旱脅迫降低番茄葉片氣孔開放率，改變生理生化反應(yīng)，從而影響番茄水分與營養(yǎng)代謝途徑[2]。干旱脅迫也可通過打破植物細(xì)胞內(nèi)Na+與K+平衡，導(dǎo)致番茄葉片水分含量發(fā)生改變，引起植物代謝紊亂和形態(tài)變化[3]。干旱脅迫還可誘導(dǎo)抗旱應(yīng)答過程中轉(zhuǎn)錄因子與基因表達(dá)，使其通過脫落酸（ABA）等信號傳導(dǎo)途徑增強(qiáng)植物對脅迫的抵抗能力[4]。植物對干旱脅迫的響應(yīng)是一個具有多種級聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜調(diào)控過程，許多轉(zhuǎn)錄因子、基因共同調(diào)控抗旱應(yīng)答信號傳導(dǎo)途徑與生理生化代謝等途徑[5-6]。當(dāng)植物遇到干旱脅迫時，植物體內(nèi)干旱脅迫應(yīng)答基因迅速表達(dá)以調(diào)控該過程，在該脅迫應(yīng)答基因調(diào)控的抗旱應(yīng)答過程中，許多轉(zhuǎn)錄因子和基因共同表達(dá)促使植物適應(yīng)脅迫過程[5]。由此可知，干旱脅迫信號引起脅迫信號傳導(dǎo)途徑中的多種基因表達(dá)，參與調(diào)控植物抗旱應(yīng)答，但應(yīng)答過程中許多調(diào)控理論機(jī)制尚不清楚，挖掘和探討未知機(jī)制對研究番茄抗旱調(diào)控具有重要理論意義。

酵母雙雜交系統(tǒng)是檢測蛋白質(zhì)間是否存在相互作用的一種技術(shù)方法[7]。該技術(shù)首次由Fields等提出，可直接驗(yàn)證已知蛋白相互作用情況，也可篩選文庫中與誘餌蛋白質(zhì)存在相互作用的新蛋白，確定新蛋白質(zhì)功能[8]。隨酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展，該技術(shù)已應(yīng)用于多種蔬菜作物。李穎波等在鹽脅迫下構(gòu)建大麥酵母雙雜交cDNA文庫[9]。雷海英等構(gòu)建玉米酵母雙雜交cDNA文庫[10]。鄒禹等構(gòu)建高鹽脅迫下水稻酵母雙雜交cDNA文庫[11]。許向陽等構(gòu)建Cf-19介導(dǎo)的抗番茄葉霉?。–ladosporium fulvum）免疫應(yīng)答酵母雙雜交cDNA文庫[12]。由此可知，酵母雙雜交系統(tǒng)在各類作物非生物脅迫、質(zhì)量性狀與病害等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

“Micro-Tom”番茄是番茄理論研究最好的模式作物，因此本研究以番茄品種“Micro-Tom”作為構(gòu)建文庫的材料，對其作PEG 6000模擬干旱脅迫，干旱脅迫后0、3與6 h“Micro-Tom”番茄材料等量混合，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫，以期為進(jìn)一步完善干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄抗旱理論研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)與PEG 6000干旱脅迫處理

“Micro-Tom”番茄材料由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院番茄課題組提供，試驗(yàn)材料種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站。2019年6月將“Micro-Tom”番茄種子播種于營養(yǎng)缽內(nèi)，覆膜保濕，避光培養(yǎng)，溫度為20～28℃，5 d左右幼苗破土。去掉覆膜，培養(yǎng)條件為:光照17 h，黑暗7 h，溫度25～30℃，濕度70%～75%，避免徒長。待幼苗長至4～5葉一心時將試驗(yàn)材料干旱脅迫處理。干旱處理:將“Micro-Tom”番茄幼苗置于15%PEG 6000溶液中模擬干旱條件。干旱脅迫早期0、3與6 h“Micro-Tom”番茄幼嫩葉片置于液氮中，保存于-80℃冰箱用于干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建。

1.2“Micro-Tom”番茄葉片總RNA提取與mRNA分離純化

將PEG6000脅迫處理后0、3與6 h番茄葉片等量混合，稱取1 g樣品在液氮下研磨用于干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建。將研磨試驗(yàn)材料加入Trizol，震蕩后加入CH3Cl離心；棄去多余液體加入異丙醇離心，收集RNA沉淀，于通風(fēng)處風(fēng)干，加入適量DEPC水溶解。最終得到干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫總RNA。

按照Oligotex mRNA Midi Kit說明書對干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫總RNA作mRNA分離與純化。首先向RNA沉淀中加入DEPC水溶解，再向其中加入buffer OBB與Oligotex suspension溶液水浴，離心后獲取沉淀。其次，向沉淀中加入OW2與buffer OEB溶液，于凝膠電泳下觀察mRNA條帶分布情況。最后，mRNA中加入NH4OAC與糖原等物質(zhì)混勻，無水乙醇清洗兩次，最終獲得已純化mRNA沉淀。利用凝膠電泳檢測mRNA質(zhì)量用于構(gòu)建干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫。

1.3 干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交初級cDNA文庫構(gòu)建

1.3.1 cDNA雙鏈合成

根據(jù)Invitrogen公司構(gòu)建cDNA文庫說明書構(gòu)建干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫。cDNA首鏈合成試劑:mRNA模板、DEPC水、dNTPs、5×First Strand Buffer與SuperScript III RT酶等。cDNA第2條鏈合成試劑:DEPC水、E.coliDNA Ligase、E.coliRNaseH、5 X Second Strand Buffer、E.coliDNA Polymerase I、 EDTA、 T4DNA Polymerase與酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)等。

1.3.2 雙鏈cDNA重組接頭連接、分級分離與收集

將雙鏈cDNA與三框attB1重組接頭連接（3種接頭分別各連接1份）。3份cDNA產(chǎn)物混合后加入TEN Buffer分級分離，向分級分離的cDNA產(chǎn)物加入以下成分于-80℃冰箱靜止:Glycogen、100%ethano與NH4OAc，靜止后室溫下離心收集沉淀；加入乙醇溶液（70%）清洗沉淀并吹干，加入DEPC水溶解獲得酵母雙雜交初級文庫cDNA。

1.3.3 cDNA重組反應(yīng)與擴(kuò)增

將擴(kuò)增的cDNA片段重組到pDONR222質(zhì)粒上得到cDNA-pDONR222重組載體，重組載體電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，加入液體培養(yǎng)基于搖床中復(fù)蘇菌體55 min。復(fù)蘇后用涂布棒涂布到固體LB培養(yǎng)基(抗生素Kanamycine)中用于庫容量與文庫滴度鑒定，剩余菌體加入甘油儲存于-80℃冰箱中，此即為干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交初級cDNA文庫菌液。

1.4 干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交次級cDNA文庫構(gòu)建

將初級cDNA文庫菌液加入液體培養(yǎng)基搖菌擴(kuò)增，12～14 h后根據(jù)Biospin Plasmid DNA Extraction Kit（博日科技有限公司，杭州）提取重組載體質(zhì)粒，按照1.3.3重組載體方法將質(zhì)粒cDNA-pDONR222與次級文庫pGADT7DEST質(zhì)粒上形成cDNA-pDONR222-pGADT7DEST重組載體。重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，搖床中復(fù)蘇菌液55 min，最后于固體培養(yǎng)基（抗生素Ampicillin）上培養(yǎng)菌落。剩余菌液加入等量甘油保存于-80℃冰箱中，即為干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交次級cDNA文庫菌液。

1.5 干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交各級cDNA文庫質(zhì)量鑒定

1.5.1 初級、次級與目的cDNA文庫庫容量檢測

將酵母雙雜交初級與次級cDNA文庫菌液10倍稀釋，稀釋后從兩個文庫中各吸取50 μL分別涂布于含Kanamycine與Ampicillin抗性的固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16 h長出菌落克隆。

酵母雙雜交初級/次級cDNA文庫滴度（CFU·mL-1）:平板上全部菌落克隆數(shù)量50 μL× 100倍×1×103μL。酵母雙雜交文庫總?cè)萘浚–FU）=酵母cDNA文庫滴度（CFU·mL-1）× 文庫菌液總體積（mL）。番茄目的酵母文庫滴度（CFU·mL-1）=平板上克隆數(shù)量/涂板菌液體積×文庫菌液稀釋倍數(shù)。

1.5.2 初級、次級與酵母cDNA文庫片段長度與重組率鑒定

初級、次級cDNA文庫固體LB培養(yǎng)基中分別選取24個單菌落，通過PCR檢測cDNA文庫中重組序列完整性。其中，初級cDNA文庫與次級cDNA文庫PCR引物均由Invitrogen公司設(shè)計(jì)并提供，而PCR反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[13]。最終，“Micro-Tom”番茄初級與次級酵母文庫cDNA文庫片段長度通過1%瓊脂凝膠電泳檢測鑒定，觀察目的條帶數(shù)量及其長度。重組率（%）=重組成功數(shù)量/全部克隆總數(shù)×100%。

1.6 干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交文庫構(gòu)建與質(zhì)量鑒定

次級cDNA酵母文庫菌液在37℃，200 r·min-1搖床中擴(kuò)繁，14～16 h后采用諾唯贊質(zhì)粒提取試劑盒提取cDNA-pDONR222-pGADT7DEST重組質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母中，具體方法如下:將次級cDNA文庫質(zhì)粒與Herring Testes Carrier DNA混合熱激與冰??；加入感受態(tài)細(xì)胞Appendix B試劑混合水浴離心等；加入3YPD Plus液體培養(yǎng)基復(fù)蘇酵母2 h；離心后加入生理鹽水（0.9%）稀釋菌塊，將菌液250 μL在SD/Leu培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共100個平板，于30℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～4 d可觀察到單菌落；將長出菌落平板放置于4℃冰箱冷卻約3～4 h，加入冷凍培養(yǎng)基，按照1.5.1方法檢測目的酵母cDNA文庫庫容量與文庫滴度，吸取100 μL酵母雙雜交cDNA文庫菌液按照1∶100、1∶1 000與1∶10 000稀釋，均勻涂布在SD/Leu培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～4 d可觀察到單菌落生成；隨機(jī)選擇單克?。?4個）置于液體培養(yǎng)基，于30 ℃，250 r·min-1搖菌14～16 h，離心4 min棄上清，加入SDS溶液重懸菌體通過PCR鑒定菌落陽性克隆數(shù)量，計(jì)算重組率。最終，將PCR產(chǎn)物加入loading Buffer在瓊脂糖凝膠電泳中檢測干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫重組序列完整性（片段長度與重組率）。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄總RNA、mRNA與ds cDNA質(zhì)量檢測

將“Micro-Tom”番茄植株作PEG 6000處理，在脅迫后0、3與6 h選取“Micro-Tom”番茄幼嫩葉片提取干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫總RNA。在1%瓊脂糖凝膠下檢測cDNA文庫總RNA質(zhì)量，如圖1a所示，圖譜中總RNA主要有兩條帶，28S主帶與18S次帶，兩條帶清晰且明亮，無明顯彌散性條帶。由此可知，cDNA文庫總RNA質(zhì)量較好，無降解。mRNA電泳圖譜如圖1b所示，mRNA條帶在500～2 000 bp范圍內(nèi)呈均勻彌散分布，證明cDNA文庫mRNA質(zhì)量較好，未發(fā)生降解。ds cDNA電泳圖譜如圖1c所示，ds cDNA條帶在較大范圍內(nèi)呈彌散性均勻分布，因此cDNA條帶完整性較高，質(zhì)量較好，可用于構(gòu)建干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫。

2.2 初級cDNA文庫構(gòu)建與鑒定

將cDNA初級酵母cDNA文庫菌液100倍稀釋后于固體LB培養(yǎng)基（含抗生素Kanamycine）上培養(yǎng)，待長出菌落后計(jì)數(shù)。

如圖2a所示，經(jīng)計(jì)算“Micro-Tom”番茄初級cDNA文庫平板上共長出1 300個克隆，初級cDNA文庫滴度為2.6×106CFU·mL-1，初級cDNA文庫庫容量為1.04×107CFU。初級cDNA文庫培養(yǎng)基中隨機(jī)選擇24個克隆檢測，電泳圖譜檢測結(jié)果顯示（見圖2b），24個克隆全部擴(kuò)增出條帶，重組率為100%，該結(jié)果從一定程度上降低克隆假陽性。24個克隆全部為500 bp以上，且插入片段平均長度＞1 000 bp。由此可知，以上數(shù)據(jù)達(dá)到構(gòu)建干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 次級cDNA文庫構(gòu)建與鑒定

將“Micro-Tom”番茄次級酵母cDNA文庫菌液按照上述方法100倍稀釋后于固體LB培養(yǎng)基（含抗生素Ampicillin）上培養(yǎng)，待長出菌落后計(jì)數(shù)。如圖3a所示，經(jīng)計(jì)算Micro-Tom番茄初級cDNA文庫平板上共長出1 700個克隆，次級cDNA文庫滴度為3.4×106CFU·mL-1，次級cDNA文庫的庫容量為1.36×107CFU。利用PCR方法檢測次級cDNA文庫重組率與插入片段長度，在次級cDNA文庫培養(yǎng)基中隨機(jī)選擇24個克隆檢測。凝膠電泳圖譜檢測結(jié)果顯示（見圖3b），24個克隆全部擴(kuò)增出條帶，重組率為10%，該結(jié)果從一定程度上降低克隆假陽性。其中，24個克隆全部為500 bp以上，片段最長為2 000 bp，有18個克隆位于1 000～2 000 bp，6個克隆片段長度位于500～1 000 bp，且插入片段平均長度＞1 000 bp。由此可知，以上數(shù)據(jù)達(dá)到構(gòu)建干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 干旱脅迫下Micro-Tom番茄酵母cDNA文庫質(zhì)量鑒定

將次級cDNA文庫菌液轉(zhuǎn)化到酵母菌株中于SD/Leu培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按100、1 000與10 000倍稀釋菌液，最后吸取100 μL稀釋度為10 000倍酵母雙雜交cDNA文庫菌液涂布培養(yǎng)，得到干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫。

由圖4a可知，該酵母雙雜交cDNA文庫平板上共長出600個克隆，文庫滴度為6.0×107CFU·mL-1。利用PCR檢測番茄cDNA酵母文庫重組率與插入片段長度，在目的酵母cDNA文庫培養(yǎng)基中隨機(jī)選擇24個克隆檢測。

根據(jù)圖4b凝膠電泳圖譜檢測結(jié)果顯示，24個克隆全部擴(kuò)增出條帶，重組率為100%，該結(jié)果從一定程度上降低克隆假陽性。其中，24個克隆全部為500 bp以上，16個克隆位于1 000～2000 bp，18個克隆片段長度位于500～1 000 bp，且插入片段平均長度＞1 000 bp。由此可知，以上數(shù)據(jù)達(dá)到構(gòu)建干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論與結(jié)論

酵母雙雜交技術(shù)是檢測蛋白質(zhì)間是否存在相互作用與篩選酵母cDNA文庫中未知功能蛋白的重要手段，對研究新蛋白質(zhì)功能與代謝途徑有重要意義[7]。目前，許多研究者構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫，為更深入研究基因與蛋白作用機(jī)理、信號傳導(dǎo)與代謝途徑奠定基礎(chǔ)。酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建方法主要有SMART法與Gateway法，SMART法構(gòu)建cDNA文庫所需RNA含量少，成本較低，僅能采用Mating方法篩選cDNA酵母文庫，局限性較大。而Gateway法所需RNA質(zhì)量較高，通過重組方法提高文庫重組率與庫容量，可采用Mating方法與共轉(zhuǎn)兩種方法篩選cDNA酵母文庫[14]。因此，本試驗(yàn)采用Gateway技術(shù)構(gòu)建干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫。

構(gòu)建高質(zhì)量cDNA酵母文庫有利于高效篩選cDNA文庫中蛋白質(zhì)，酵母雙雜交cDNA文庫質(zhì)量主要通過庫容量與重組序列完整性兩方面判斷[15]。庫容量是構(gòu)建cDNA文庫中全部克隆的數(shù)目，其數(shù)量代表cDNA文庫覆蓋度，1個完整的酵母cDNA文庫的文庫滴定度需達(dá)1.0×106CFU·mL-1以上為合格[16]。本研究初級酵母cDNA文庫、次級酵母cDNA文庫與“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫的文庫滴定濃度分別是為2.6×106、3.4×106與6.0×107CFU·mL-1。周汐等構(gòu)建大豆酵母雜交cDNA文庫的文庫滴度為1.0×107CFU·mL-1[17]。王玉姣等構(gòu)建辣椒疫霉菌誘導(dǎo)辣椒酵母雙雜交cDNA文庫的文庫滴度為1.13×106CFU·mL-1[18]。由此可知，本研究構(gòu)建的干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫的庫容量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，相比之下該酵母雙雜交cDNA文庫種類更豐富，覆蓋度更完整。

基因重組率與插入基因片段長度代表基因重組序列完整性[19]。其中，cDNA文庫平均插入片段需達(dá)1 000 bp以上才可達(dá)到構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫的標(biāo)準(zhǔn)[20]。重組率是重組載體成功的數(shù)目與克隆總數(shù)百分比，一定程度上反映文庫中菌落假陽性出現(xiàn)概率。本試驗(yàn)初級、次級與“Micro-Tom”番茄酵母cDNA文庫平均插入基因片段長度均＞1 000 bp，重組率均為100%，降低該cDNA文庫中菌落假陽性概率，以上數(shù)據(jù)均達(dá)到構(gòu)建cDNA文庫要求。劉露露等構(gòu)建霜霉菌侵染后葡萄葉片酵母雙雜交cDNA文庫的平均插入片段長度＞1 kb，重組率為96%[14]。鄒禹等構(gòu)建水稻高鹽脅迫下酵母雙雜交文庫平均插入片段長度＞1 kb，文庫重組率為96%[11]。本研究構(gòu)建干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫質(zhì)量較高。

本研究通過Invitrogen公司Gateway技術(shù)完成干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建。結(jié)果表明，“Micro-Tom”番茄初級cDNA文庫與次級cDNA文庫的文庫滴度分別為為2.6×106與3.4×106CFU·mL-1，文庫總庫容量分別為1.04×107與1.36×107CFU。干旱脅迫下“Micro-Tom”番茄酵母雙雜交cDNA文庫滴度為6.0×107CFU·mL-1。初級、次級與“Micro-Tom”番茄酵母cDNA文庫重組率均為100%，各級文庫插入片段長度大多數(shù)均在1 000～2 000 bp，插入片段平均長度均＞1 kb。說明構(gòu)建cDNA文庫質(zhì)量及完整度較好，可用于篩選互作蛋白文庫。