CYP2C19基因型與復發(fā)性腦梗死患者氯吡格雷抵抗的關(guān)系研究

郝亞南，沈和平，張曉玲

腦梗死具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率特點，嚴重影響人類健康。復發(fā)性腦梗死（recurrent cerebral infarction，RCI）的死亡率及致殘率均高于首次發(fā)病。近年來數(shù)據(jù)顯示，我國腦梗死年復發(fā)率高達17.7%[1]，有效的二級預防是減少復發(fā)和死亡的重要手段?？寡“逅幬锬軌蛴行ьA防腦梗死的發(fā)病及復發(fā)，現(xiàn)已得到循證醫(yī)學的支持[2]。氯吡格雷是國內(nèi)外腦梗死二級預防指南推薦使用的一線抗血小板藥物，用于高危患者腦梗死復發(fā)的預防[3]。然而，臨床工作中發(fā)現(xiàn)，部分患者即使長期、規(guī)律地服用氯吡格雷，仍有卒中復發(fā)的風險。目前已有較多的基礎(chǔ)和臨床研究證實部分患者存在氯吡格雷抵抗，而且有研究顯示，氯吡格雷抵抗與CYP2C19基因多態(tài)性有關(guān)[4-5]。2010年美國食品和藥品監(jiān)督管理局對氯吡格雷增加了“黑框警告”，建議加強對氯吡格雷治療的患者進行CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因的檢測，對CYP2C19基因純合突變患者考慮換用其他抗血小板藥物或改變氯吡格雷的劑量方案。目前，我國《中國缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作二級預防指南2014》[1]中并未對CYP2C19基因檢測予以規(guī)定，并且RCI患者服用氯吡格雷后血小板聚集情況與CYP2C19基因關(guān)系的研究較少。本研究探討氯吡格雷對CYP2C19不同基因型復發(fā)性腦梗死患者血小板聚集功能的抑制情況，根據(jù)氯吡格雷抵抗情況進行不同的藥物治療策略，隨訪3個月患者卒中復發(fā)情況，為個體化治療提供理論依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 本研究是前瞻性研究，連續(xù)納入2018年1-10月就診于嘉興市第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診斷為RCI的患者進行CYP2C19基因測序，收集氯吡格雷快代謝、中代謝、慢代謝型患者各30例。

入組標準：①年齡40～90歲；②復發(fā)性腦梗死患者，腦梗死符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》中急性缺血性卒中診斷標準；③此次發(fā)病時間在7 d內(nèi)，生命體征平穩(wěn)，NIHSS評分≤25分；④腦梗死考慮為中國缺血性卒中分型診斷（China Ischemic Stroke Subclassification，CISS）中大動脈粥樣硬化型或穿支動脈疾??；⑤首次腦梗死后規(guī)律應(yīng)用阿司匹林進行二級預防；⑥接受CYP2C19基因測序檢查并明確其基因分型（快代謝、中代謝、慢代謝基因型）者。

排除標準：①既往使用氯吡格雷或氯吡格雷過敏；②首次腦梗死；③嚴重高血壓、糖尿病、肺部感染；④心源性栓塞及非動脈粥樣硬化性血管狹窄患者，包括各種血管炎、血管痙攣、夾層動脈瘤或煙霧??；⑤頸內(nèi)動脈曾行內(nèi)膜剝脫術(shù)或支架治療、存在腦血管畸形或動靜脈瘺的患者；⑥不能完成復查或者依從性差的患者。

本研究經(jīng)嘉興市第二醫(yī)院倫理委員會審批，對入組患者進行充分告知，取得知情同意，簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 研究流程 ①對RCI患者進行氯吡格雷基因檢測，納入快代謝、中代謝和慢代謝基因型各30例；②入組所有患者均服用氯吡格雷75 mg/d連續(xù)7 d，于服藥前及7 d后晨起空腹狀態(tài)下留取靜脈血標本檢測血小板聚集率，根據(jù)血小板聚集抑制率，篩選出氯吡格雷抵抗者分至氯吡格雷抵抗組，改用西洛他唑100 mg，2次/日，氯吡格雷敏感及氯吡格雷半反應(yīng)者分至非氯吡格雷抵抗組，繼續(xù)氯吡格雷75 mg/d治療；③3個月后隨訪患者終點事件發(fā)生情況（主要終點：再發(fā)腦梗死；次要終點：腦出血和死亡），并再次檢測血小板聚集率。

觀察分析指標：①比較快代謝、中代謝和慢代謝3組患者基線資料及氯吡格雷抵抗的發(fā)生率；②比較氯吡格雷抵抗及非氯吡格雷抵抗組年齡、性別、BMI、吸煙（每天吸煙1支以上，連續(xù)或累計6個月及以上）、CYP2C19基因慢代謝、高血壓、糖尿病及高脂血癥等一般臨床資料，分析CYP2C19基因型與復發(fā)性腦梗死患者氯吡格雷抵抗的關(guān)系；③比較氯吡格雷抵抗及非氯吡格雷抵抗組3個月時血小板聚集抑制率以及兩組3個月后終點事件發(fā)生情況（圖1）。

1.2.2 CYP2C19基因檢測方法 利用CYP2C19基因芯片檢測系統(tǒng)（中國上海百傲科技有限公司）檢測：①提取全血DNA；②PCR擴增目的基因；③芯片雜交顯色；④將芯片上的色斑經(jīng)信號放大；⑤通過基因芯片圖像分析軟件 Array Doctor V2.0對結(jié)果進行掃描和自動判讀，判定CYP2C19 基因型信息。并設(shè)陽性（含CYP2C19*2G和CYP2C19*2A、CYP2C19*3G和CYP2C19*3A的質(zhì)?；旌弦海┘瓣幮裕瞻讓φ眨φ者M行質(zhì)量控制?；驒z測結(jié)果CYP2C19*1/*1為快代謝基因型，CYP2C19*1/*2及CYP2C19*1/*3為中代謝基因型，CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3及CYP2C19*2/*3為慢代謝基因型。

圖1 研究流程圖

1.2.3 血小板聚集率的檢測方法 采用光學比濁法檢測血小板聚集率：入組患者服用氯吡格雷前及7 d后晨起空腹狀態(tài)下留取靜脈血標本，加入枸櫞酸抗凝，離心獲取富血小板血漿，吸取0.5 mL血漿于放有鎳芯磁棒的反應(yīng)杯中37 ℃溫育5 min，設(shè)置磁棒的旋轉(zhuǎn)速度為1200 r/min，將反應(yīng)杯轉(zhuǎn)到檢測孔繼續(xù)溫育5 min，加入促凝劑5-腺苷二磷酸二鈉鹽（終濃度為20 μmol/L）進行血小板聚集反應(yīng)檢測，待曲線平穩(wěn)后停止反應(yīng)，記錄血小板最大聚集率。

氯吡格雷抵抗評價標準：參照Müller定義[6-8]。血小板聚集抑制率＜10%為氯吡格雷抵抗，10%～30%為氯吡格雷半反應(yīng)，≥30%為氯吡格雷敏感。血小板聚集抑制率為服用氯吡格雷7 d后最大血小板聚集率較治療前最大血小板聚集率（基線值）下降的數(shù)值。

血小板聚集抑制率（%）=治療前基線值-用藥后最大血小板聚集率。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間正態(tài)分布的計量資料以表示，采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)（%）表示，比較采用四格表χ2檢驗。三組間計數(shù)資料以頻數(shù)（%）表示，比較采用多組獨立樣本χ2檢驗。以氯吡格雷抵抗為因變量，以性別、年齡、BMI、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥、CYP2C19基因型為自變量，采用多因素Logistic回歸分析氯吡格雷抵抗的獨立危險因素，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

最終入組符合入排標準的RCI患者90例，其中男性49例（54.4%），女41例（45.6%），年齡40～89歲，平均年齡68.27±10.14歲。所有患者3個月隨訪均無終點事件發(fā)生。

2.1 不同CYP2C19基因型分組氯吡格雷抵抗情況 快、中、慢代謝3組在合并糖尿病方面差異有統(tǒng)計學意義（P=0.036），兩兩比較顯示慢代謝組合并糖尿病比例高于中代謝組（P=0.010），快代謝與中代謝及快代謝與慢代謝組之間差異無統(tǒng)計學意義；3組在性別、年齡、BMI、高血壓、高脂血癥等方面差異無統(tǒng)計學意義?？齑x組有2例（6.7%）、中代謝組有5例（16.7%）、慢代謝組有15例（50.0%）出現(xiàn)氯吡格雷抵抗（表1）。3組氯吡格雷抵抗率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；兩兩比較顯示，慢代謝組氯吡格雷抵抗發(fā)生率高于快代謝組（P＜0.001）及中代謝組（P=0.006），快代謝與中代謝組氯吡格雷抵抗率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.421）。

2.2 不同氯吡格雷抵抗組基線資料比較 入組7 d后根據(jù)血小板聚集抑制率分為非氯吡格雷抵抗組68例，氯吡格雷抵抗組22例，其中非氯吡格雷抵抗組患者的吸煙、糖尿病和CYP2C19基因慢代謝型比例明顯低于氯吡格雷抵抗組，差異有統(tǒng)計學意義；兩組性別、年齡、BMI、高血壓、高脂血癥等方面差異無統(tǒng)計學意義（表2）。

2.3 氯吡格雷抵抗危險因素的Logistic回歸分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示吸煙、糖尿病及CYP2C19慢代謝基因型為復發(fā)性腦梗死患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨立影響因素（表3）。

表1 不同CYP2C19基因型患者氯吡格雷抵抗情況

表2 不同氯吡格雷抵抗分組基線資料比較

2.4 兩組3個月后的血小板聚集抑制率情況 3個月后隨訪，非氯吡格雷抵抗組（氯吡格雷治療）和氯吡格雷抵抗組（西洛他唑治療）患者3個月后的血小板平均聚集率較本組7 d時均下降，差異有統(tǒng)計學意義，說明氯吡格雷抵抗者服用西洛他唑可有效抑制血小板聚集。且3個月后兩組比較，氯吡格雷抵抗組血小板聚集抑制率更高（P＜0.001）（表4）。

表3 氯吡格雷抵抗危險因素的Logistic回歸分析

表4 兩組3個月后血小板聚集抑制率情況

3 討論

目前氯吡格雷抵抗已越來越受關(guān)注，研究表明，使用常規(guī)劑量氯吡格雷的患者有4%～30%會出現(xiàn)氯吡格雷抵抗[9-10]，在缺血性腦血管病中其發(fā)生率為28%[10-12]，而氯吡格雷抵抗患者中高達40%可能會再發(fā)血栓事件[13-14]。本研究檢測90例RCI患者的血小板聚集率，發(fā)現(xiàn)22例（24.4%）出現(xiàn)氯吡格雷抵抗。

氯吡格雷抵抗會增加缺血事件的發(fā)生率[15-16]，但氯吡格雷抵抗的機制尚未完全闡明，可能是由于基因變異或藥物相互作用等導致氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物的生物利用度降低[17]。目前引起氯吡格雷抵抗的因素主要可分為遺傳性因素（如基因多態(tài)性）和非遺傳性因素（如藥物相互作用、患者本身等）。遺傳因素中的CYP2C19 基因多態(tài)性對氯吡格雷藥效的影響很早就受到關(guān)注，目前已知CYP2C19變異等位基因數(shù)已超過25個，但亞洲人群中與氯吡格雷抵抗相關(guān)的突變體為CYP2C19*2、CYP2C19*3[18]。吳小利等[19]研究發(fā)現(xiàn)CYP2C19*2、CYP2C19*3等位基因突變易發(fā)生氯吡格雷抵抗。Kim等[20]研究發(fā)現(xiàn)在攜帶CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因的患者，氯吡格雷對血小板的抑制作用減弱。宋博凡等[21]研究也有相似的結(jié)論。本研究也發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因慢代謝組（*2/*2、*2/*3、*3/*3）患者氯吡格雷抵抗發(fā)生率明顯高于快代謝組及中代謝組，提示慢代謝與氯吡格雷抵抗的發(fā)生有相關(guān)性，與既往報道一致。

目前公認CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷的療效起決定性作用[22]。然而本研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因慢代謝組中仍有50%患者未發(fā)生氯吡格雷抵抗，顯然氯吡格雷抵抗不僅取決于CYP2C19基因型，還與其他因素有關(guān)，如非遺傳因素。有文獻報道糖尿病患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的概率較非糖尿病患者高[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病是氯吡格雷抵抗的獨立危險因素，與Nakagawa等[25]研究結(jié)果相一致，考慮可能與糖尿病患者體內(nèi)發(fā)生血管內(nèi)皮損傷氧化應(yīng)激導致血小板的活性增強有關(guān)。另外，有文獻報道吸煙攝入的煙堿作為肝細胞色素CYP1A2活性的誘導劑，與氯吡格雷無反應(yīng)有關(guān)[26]。但關(guān)于吸煙對氯吡格雷抵抗的研究較少，本研究中發(fā)現(xiàn)吸煙也是RCI患者氯吡格雷抵抗的獨立危險因素，考慮與吸煙影響全身血管和血液系統(tǒng)有關(guān)，吸煙不僅加速血管硬化，還可以升高血漿纖維蛋白原水平、促進血小板聚集等。有文獻報道體重指數(shù)增高是氯吡格雷抵抗的危險因素[27]，本研究中未發(fā)現(xiàn)BMI與氯吡格雷抵抗有關(guān)，考慮與本研究以超重（BMI≥24 kg/m2）非肥胖為標準有關(guān)，并且與樣本量少也有一定關(guān)系。

西洛他唑在腦梗死二級預防的地位日趨升高，有的研究發(fā)現(xiàn)西洛他唑在腦梗死二級預防的療效與安全性方面較阿司匹林及氯吡格雷更優(yōu)[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，對氯吡格雷抵抗的復發(fā)性腦梗死患者，西洛他唑可有效抑制血小板聚集，且無終點事件發(fā)生，也證實了西洛他唑的有效性及安全性。

本研究的不足之處：①本研究的樣本量較小，隨訪時間不夠長，故無法判斷西洛他唑在二級預防中的長期效果；②影響氯吡格雷代謝的因素比較多，除基因（CYP2C19、ABCB1等）多態(tài)性外，還包括藥物（質(zhì)子泵抑制劑、他汀類藥物等）的相互作用、合并其他基礎(chǔ)疾?。ㄌ悄虿　⒏咧Y等）及患者依從性。因此，僅通過檢測CYP2C19基因多態(tài)性來決定患者的抗血小板治療策略并不是最優(yōu)方案，需要結(jié)合患者具體情況及血小板聚集率綜合分析，并且需要大樣本、前瞻性、多中心隨機對照研究來證實，以便預測氯吡格雷抵抗的發(fā)生，更合理地指導臨床用藥。