桃金娘提取物體外抑菌試驗(yàn)

劉海隆,包佳鷺,李雪嬌,郭 月,趙興華

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,海南?？?71100 ； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北保定071000)

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa)為桃金娘科桃金娘屬常綠小灌木，別名山稔、崗稔、稔子，廣泛生長于熱帶地區(qū)，是我國南方常見的觀賞植物[1]，具有生長迅速，資源豐富，可用價值高的特點(diǎn)。在我國古代就有對桃金娘藥用價值的記載，民間常用桃金娘治療痢疾、腹瀉等疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，桃金娘具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等多種功效[2]。

在我國的畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，細(xì)菌性疾病的發(fā)病率高，且由于抗生素被長期大量使用，細(xì)菌的耐藥性較強(qiáng)，不易治療，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了嚴(yán)重危害。沙門菌和金黃色葡萄球菌是臨床上常見的致病菌,是引起細(xì)菌性食物中毒的主要細(xì)菌，我國發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒事件40%是由沙門菌引起的[3]，20%～25%是由金黃色葡萄球菌引起的[4]，而大多數(shù)食物中毒事件都是由畜禽產(chǎn)品引發(fā)的。沙門菌病是規(guī)模化養(yǎng)殖場的主要致病菌之一，對幼畜危害較大，主要引起雞白痢、仔豬副傷寒等疾病，表現(xiàn)為敗血癥、腸炎，也能導(dǎo)致孕畜流產(chǎn)[5]。金黃色葡萄球菌是化膿性感染中最常見的病原菌，主要引起奶牛乳房炎，可導(dǎo)致敗血癥及膿毒癥等嚴(yán)重感染[6]，它具有較強(qiáng)的耐藥性，對我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。

近年來，由于抗生素被大量使用，細(xì)菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，多重耐藥菌的出現(xiàn)使臨床防治變得十分困難。中藥屬于天然藥物，具有低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，研究中藥的抑菌作用有利于找到抗生素替代品。本試驗(yàn)對桃金娘葉、果的體外抑菌作用進(jìn)行了研究，為桃金娘的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料 桃金娘于2018年7月采集于海南省。

1.2 試劑與菌株 大腸桿菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌為臨床分離菌株各1株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病教研室提供。麥康凱培養(yǎng)基、S.S.瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基，均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桃金娘水煎液的制備 將桃金娘葉或果實(shí)粉碎，過200目篩，稱取 10 g加 100 mL純化水，煎煮 30 min，過濾，藥渣再加純化水 100 mL，煎煮30 min后合并 2 次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至 10 mL， 使每毫升含中藥 1 g(濃度為1 g/mL)，于 4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 桃金娘醇提液的制備 將桃金娘葉或果實(shí)粉碎，過 200 目篩，稱取 10 g 加 100 mL 75%乙醇，在 75 ℃下水浴回流 3 h，重復(fù) 3 次，合并濾液，再用回旋蒸發(fā)儀濃縮至 10 mL，使每毫升含中藥 1 g (濃度為1 g/mL)，保存在 4 ℃冰箱中備用。

1.3.3 菌液制備 將菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng) 12 h。挑取單個菌落接種于 3 mL營養(yǎng)肉湯中，搖床 37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，配制成 105CFU/mL濃度的菌液。

1.3.4 瓊脂擴(kuò)散藥敏法測量抑菌圈 按無菌操作規(guī)程，吸取菌液 100 μL均勻涂布于MH瓊脂平板，用打孔器等距離打孔，滴少量的瓊脂于孔內(nèi)封底，防止藥液從孔底流走。每孔加入無菌藥液，空白對照孔加入生理鹽水，于 37 ℃培養(yǎng) 24 h后觀察并測量其抑菌圈直徑。每種提取液每個菌種做 3 個平行試驗(yàn)，抑菌圈取其平均值。

1.3.5 微量倍比稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC) 無菌條件下，在 96 孔板中用肉湯培養(yǎng)基將提取液倍比稀釋成含生藥量0.5、0.25、0.125、0.063、0.032 g/mL和0.016 g/mL，將配制好的菌液加入各孔，設(shè)置陰性對照孔(生理鹽水)，陽性對照孔(菌液)，37 ℃培養(yǎng) 24 h，陰性對照孔清澈，陽性對照孔渾濁，觀察其他各孔渾濁度。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂擴(kuò)散法測量抑菌圈 桃金娘醇提液抑菌效果優(yōu)于桃金娘水提液，其中桃金娘葉的醇提液抑菌效果優(yōu)于桃金娘果醇提液。桃金娘葉醇提液對金黃色葡萄球菌和沙門菌的抑菌作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑為16.77 mm、13.66 mm，而對大腸桿菌沒有抑菌效果，結(jié)果見表1。

表1 桃金娘葉、果的水提和醇提液對不同菌種的抑菌作用Table 1 Bacteriostatic effect of water extract and Alcohol extract of myrtle leaves and fruits on different bacteria (mean±SD,n=3)

2.2 微量倍比稀釋法測定MIC 桃金娘醇提液的抑菌效果較水提液強(qiáng)，桃金娘葉的醇提液對金黃色葡萄球菌和沙門菌的MIC值分別為 0.125 g/mL和0.25 g/mL，桃金娘果的醇提液對金黃色葡萄球菌和沙門菌的MIC值分別為0.25 g/mL和0.5 g/mL，結(jié)果見表2。

2.3 不同濃度桃金娘醇提液的抑菌效果 桃金娘葉的醇提液對沙門菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用隨濃度的增加而變大。濃度為1、2 g/mL和 3 g/mL的桃金娘葉醇提液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為 16.53、17.43 mm和 18.74 mm，對沙門菌的抑菌圈直徑分別為 13.47、14.57 mm和 15.35 mm，結(jié)果見表3。

表2 桃金娘葉、果的水提和醇提液對不同菌種的 MICTable 2 Effect of Water extract and Alcohol extract of myrtle leaves and fruit on MIC of different bacteria (g/mL,n=3)

表3 不同濃度桃金娘葉醇提液的抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effect of alcohol extract of myrtle leaves with different concentrations (mean±SD,n=3)

3 討論

隨著綠色健康養(yǎng)殖的觀念逐漸深入人心，中藥在養(yǎng)殖業(yè)中有著越來越廣闊的發(fā)展前景，桃金娘具有產(chǎn)量高，資源豐富，價格低廉的特點(diǎn)，且味道甘甜，適口性好，易于被家畜接受，具有良好的應(yīng)用價值。桃金娘藥性平，味甘澀，根、葉、果實(shí)均可入藥，且功效各不相同，桃金娘根具有通經(jīng)活絡(luò)，收斂止血的功效[7]；葉具有收斂解毒，健脾益血的功效[8]；果實(shí)具有養(yǎng)血止血，澀腸固精的功效[9]。谷榮輝等[10]采用高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜分析出桃金娘葉特有的 4 種標(biāo)識性化合物，證實(shí)其化學(xué)成分與果實(shí)存在差異。桃金娘含單寧類、多糖類、黃酮類、酚類、三萜類、揮發(fā)油類等活性成分[11]，其中大部分化學(xué)成分均可溶解于水和乙醇，因此，我們選取了桃金娘葉子和果實(shí)，并分別對其進(jìn)行水提和醇提，研究桃金娘不同部位的不同抑菌效果。

近年來許多學(xué)者對桃金娘的抗菌作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)桃金娘提取物具有一定的抑菌活性。Limsuwan等[12]發(fā)現(xiàn)桃金娘葉乙醇提取物對化膿性鏈球菌具有良好的抑菌活性。Saising等[13-14]研究表明，桃金娘乙酸乙酯提取物對葡萄球菌及痤瘡丙酸桿菌具有顯著抑制作用。周學(xué)明等[15]發(fā)現(xiàn)，桃金娘葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌具有一定的抗菌活性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，桃金娘葉、果水提液和醇提液對臨床分離的沙門菌及金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，醇提液的抑菌作用高于水提液，且抑菌作用隨濃度增加而增強(qiáng)，桃金娘葉的抑菌效果較果實(shí)強(qiáng)，桃金娘葉、果對大腸桿菌均無抑菌作用，為桃金娘的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。