Yes相關(guān)蛋白在膿毒癥患者PBMC中的表達(dá)及意義

吳雙華　謝璨燦　李崢嶸　曾維忠　王婷

【摘要】目的 探討Yes 相關(guān)蛋白（YAP）在膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中的表達(dá)情況及臨床意義。方法 檢測(cè)65例膿毒癥患者（膿毒癥組）和36名健康志愿者（對(duì)照組）PBMC中YAP mRNA的表達(dá)水平。根據(jù)28 d臨床結(jié)局將膿毒癥組分為死亡亞組（26例）和存活亞組（39例），比較2個(gè)亞組的急性生理學(xué)及慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)（APACHE Ⅱ）評(píng)分和PBMC中YAP mRNA的表達(dá)水平，采用Pearson相關(guān)分析兩類指標(biāo)的相關(guān)性，并用受試者工作特征（ROC）曲線分析YAP mRNA表達(dá)水平預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的效果。結(jié)果 膿毒癥組和對(duì)照組一般情況具可比性（P > 0.05）。膿毒癥組PBMC中YAP mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組（P < 0.05）。死亡亞組患者入院時(shí)的APACHE Ⅱ評(píng)分及PBMC中YAP mRNA表達(dá)水平均高于存活亞組（P < 0.05）。膿毒癥患者PBMC中YAP mRNA表達(dá)水平與APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān)（r = 0.660，P < 0.05），YAP mRNA表達(dá)水平預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的ROC曲線的曲線下面積為0.691，靈敏度和特異度均為0.692。結(jié)論 膿毒癥患者PBMC中的YAP表達(dá)水平高于健康者且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，有助于判斷患者的病情嚴(yán)重程度與預(yù)測(cè)預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】Yes相關(guān)蛋白;膿毒癥;外周血單個(gè)核細(xì)胞

【Abstract】Objective To investigate the expression and clinical significance of Yes-associated protein （YAP） in peripheral blood mononuclear cells （PBMC） of sepsis patients. Methods The expression levels of YAP mRNA in PBMC were detected in 65 sepsis patients （sepsis group） and 36 healthy volunteers （control group）. According to the clinical outcome at day 28， the sepsis group was divided into death subgroup （26 cases） and survival subgroup （39 cases）. The acute physiology and chronic health status scoring system （APACHE Ⅱ） score and YAP mRNA expression level in PBMC were compared in two groups. Pearson correlation was used to analyze the correlation between two types of indices. Receiver-operating characteristic curve （ROC） was used to analyze the effect of YAP mRNA expression levels in predicting prognoses of sepsis patients. Results The general conditions of sepsis group and control group were comparable （P > 0.05）. The expression level of YAP mRNA in PBMC in sepsis group was higher than that in control group （P < 0.05）. Patients in death subgroups had higher APACHEⅡ scores and YAP mRNA expression levels in PBMC on admission to hospital than those in survival subgroup （P < 0.05）. The expression level of YAP mRNA in sepsis patients was positively correlated with the APACHE Ⅱ score （r = 0.660， P < 0.05）. The area under the curve of ROC that predicts prognoses of sepsis patients based on YAP mRNA expression levels was 0.691. Both the sensitivity and the specificity were 0.692.? Conclusion The YAP expression levels in PBMC were higher in sepsis patients than in healthy subjects and possitively correlated with the severity of sepsis， which was helpful to judge the severity of sepsis and predict the prognoses of patients.

【Key words】Yes-associated protein;Sepsis;Peripheral blood mononuclear cells

膿毒癥是目前臨床上急危重癥患者死亡的主要原因之一[1]。Yes相關(guān)蛋白（YAP）作為一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子，能與多種蛋白質(zhì)相互作用并激活對(duì)細(xì)胞存活、趨化、分化和增殖起重要作用的靶基因的表達(dá)，是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中 Hippo 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子[2]。近年來(lái)的研究顯示有部分革蘭陽(yáng)性菌通過(guò) Toll 依賴性途徑激活果蠅中的Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提示YAP在炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮一定的調(diào)控效應(yīng)[3-4]。在本研究中，筆者通過(guò)觀察膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中YAP的表達(dá)水平及其與患者急性生理學(xué)及慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)（APACHE Ⅱ）評(píng)分的相關(guān)性，探討YAP是否參與膿毒癥的發(fā)生過(guò)程及其能否作為判斷患者病情嚴(yán)重程度與預(yù)后的指標(biāo)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

將2018年1月至2019年12月我院收治的65例膿毒癥患者設(shè)為膿毒癥組，其中男51例、女14例，年齡（51.5±16.9）歲，其中腹腔感染25例、泌尿系統(tǒng)感染21例、肺部感染15例、皮膚軟組織感染4例。根據(jù)28 d臨床治療結(jié)局又將65例患者分為死亡亞組和存活亞組，其中死亡26例、存活39例。全部病例符合2016年國(guó)際膿毒癥與感染性休克治療指南制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。全部病例均排除以下情況：住院時(shí)間小于72 h;年齡< 18歲或> 80歲;孕期或哺乳期婦女;合并有惡性腫瘤、原有免疫功能缺陷性疾病、慢性腎臟疾病、終末期肝衰竭、心肺復(fù)蘇后、持續(xù)感染性疾病如HIV感染、結(jié)核感染及長(zhǎng)期使用免疫抑制藥物和細(xì)胞毒性藥物;放棄治療及其他原因?qū)е虏v資料收集不完整。將同時(shí)期的36名健康志愿者設(shè)為對(duì)照組，其中男28名、女8名，年齡（46.1±13.3）歲。本研究通過(guò)了我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，并取得了所有參與研究的患者或家屬及志愿者的知情同意。

二、方 法

1.主要試劑與儀器

TRIzolTM LS Reagent（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）、YAP引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]、人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液試劑盒P8680（北京Solarbio科技有限公司）、2，3二羥基丙醛3磷酸脫氫酶（GAPDH）[生工生物工程（上海）股份有限公司]、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）;PCR擴(kuò)增儀SLAN-96S（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。

2.操作步驟

采集膿毒癥患者（入院時(shí)）及健康志愿者外周靜脈血10 ml，加入乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）抗凝管，按照人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)分離單個(gè)核細(xì)胞，加入RNA穩(wěn)定劑中保存，再置于-70℃冰箱保存待檢。按照TRIzolTM LS Reagent的使用說(shuō)明書(shū)提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA，提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)260 nm和280 nm的光密度（A）值，并計(jì)算A260/A280以估測(cè)RNA的純度，若A260/A280值≥1.8，表明RNA樣品沒(méi)有蛋白質(zhì)的殘留，可以備用，獲取RNA濃度值。稀釋后的總RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體反應(yīng)體系如下：5×PrimeScript Buffer 4 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl，Oligo dT Primer 1 μl，Random 6 mers 1 μl，稀釋后的RNA 13 μl（總共20 μl體系）;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃15 s。依據(jù) Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的 GAPDH及YAP序列，采用Pmerremier 5.0軟件設(shè)計(jì)人源引物，引物序列如下：GAPDH：上游5-GATTTGGTCGTATTGGGCGC-3，下游5-T?TCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3;YAP引物：上游5-TTGGCTAGACCCAAGGCTTG-3，下游5-GTTGCTGCTGGTTGGAGTTG-3。將逆轉(zhuǎn)錄得到的反向轉(zhuǎn)錄DNA（cDNA）稀釋之后，用PCR擴(kuò)增儀SLAN-96S測(cè)定其擴(kuò)增表達(dá)。其反應(yīng)體系總共20μl（cDNA 2 μl、滅菌水 6 μl、基因前引物0.8 μl、基因后引物0.8 μl、TB Green Premix Ex Tap Ⅱ 10 μl、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl）。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參。最后結(jié)果采用2-△△Ct（△Ct = Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，-△△Ct=△Ct對(duì)照組基因-△Ct膿毒癥組基因）計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

3.觀察指標(biāo)

計(jì)算患者的APACHE Ⅱ評(píng)分。檢測(cè)膿毒癥組和對(duì)照組PBMC YAP mRNA表達(dá)情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用表示，2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，并用受試者工作特征（ROC）曲線分析YAP mRNA表達(dá)水平預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的效果。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、膿毒癥組和對(duì)照組一般情況和PBMC YAP mRNA表達(dá)情況比較

膿毒癥組和對(duì)照組的性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。2組的外周血單個(gè)核細(xì)胞YAP mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.45±0.27和1.11±0.28，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），見(jiàn)表1。

二、膿毒癥患者APACHE Ⅱ評(píng)分、YAP mRNA表達(dá)及兩者的相關(guān)性

死亡亞組和存活亞組患者入院時(shí)的APACHE Ⅱ評(píng)分分別為（21.89±5.63）分與（15.64±5.21）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 4.581，P < 0.001）;2亞組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞YAP mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.54±0.28、1.38±0.24，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 2.468，P = 0.016）。膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞YAP mRNA表達(dá)水平與APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān)（r = 0.660，P < 0.05）

三、YAP mRNA表達(dá)水平預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的ROC

YAP mRNA預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的ROC曲線的曲線下面積為0.691 （95%CI為 0.549 ～ 0.832，P < 0.01），Cut-off值為1.485，靈敏度和特異度均為0.692，見(jiàn)圖1。

討論

膿毒癥已成為當(dāng)前急危重癥醫(yī)學(xué)臨床救治過(guò)程中面臨的最主要的和最棘手的情況之一，是感染致死的主要原因。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展進(jìn)步，新的診療方案、手段和藥物不斷被提出，但是在臨床治療中膿毒癥的發(fā)病率仍在上升，病死率高達(dá)20% ～ 30%[6]。而經(jīng)過(guò)積極救治幸存下來(lái)的患者中又有300余萬(wàn)例存在著不同程度的認(rèn)知功能障礙致其生活不能完全自理[6]。因此盡早識(shí)別、積極診治和早期評(píng)估療效及預(yù)后并提高膿毒癥救治的成功率和有效率是醫(yī)務(wù)人員和患者及家屬共同關(guān)注的問(wèn)題[6-7]。

Hippo信號(hào)通路主要由一系列相對(duì)高度保守的激酶所構(gòu)成，是一條主要抑制細(xì)胞生長(zhǎng)分化的信號(hào)通路，其主要作用在于調(diào)控機(jī)體干細(xì)胞的自我分化更新的能力和調(diào)節(jié)機(jī)體臟器的形態(tài)大小的變化[8]。YAP是近年來(lái)研究者新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，是Hippo信號(hào)通路的主要下游效應(yīng)物。該蛋白主要與非受體酪氨酸激酶 YES 的 SH3片段緊密結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其富含脯氨酸成分，估計(jì)分子量約為65 kD，人類YAP主要位于染色體11q22區(qū)[9]。作為調(diào)控 Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白，YAP在調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷徙、趨化和凋亡、壞死等過(guò)程中均起著至關(guān)重要的作用[10]。以往YAP研究的熱點(diǎn)多聚焦于腫瘤相關(guān)領(lǐng)域，研究顯示YAP在肝癌、肺癌、腎癌及婦科腫瘤等的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著極其重要的角色[11]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示YAP在調(diào)控炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起相當(dāng)重要的作用。

本課題組主要通過(guò)研究膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的YAP基因表達(dá)以了解其變化及臨床意義。本研究中的膿毒癥患者以男性為主，年齡以中老年為多，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果類似[3]。而本研究中的患者主要在綜合ICU中接受治療，其病種較廣泛，以腹腔感染、泌尿系統(tǒng)感染和肺部感染最常見(jiàn)，這與大多數(shù)綜合ICU收治病種相似[5]。

本研究中膿毒癥組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞YAP mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組。胡迎春等[12]通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)構(gòu)建大鼠膿毒癥模型，建模 48 h后，與正常組和假手術(shù)組相比，膿毒癥組大鼠肝臟組織中 YAP1 基因及蛋白表達(dá)水平增加（P < 0.05）。初步驗(yàn)證了Hippo信號(hào)通路中的YAP 因子可能參與了膿毒癥肝臟病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。左文等[13]通過(guò)內(nèi)毒素刺激小鼠巨噬細(xì)胞構(gòu)建膿毒癥細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞分化，并通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)去磷酸化的YAP表達(dá)水平升高，磷酸化的YAP表達(dá)水平降低，所以他們推測(cè)去磷酸化的YAP可能與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

YAP在膿毒癥中升高的原因和具體機(jī)制尚未完全明確。有研究表明YAP是血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和炎癥的基本調(diào)節(jié)劑，炎癥介質(zhì)可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞YAP的高表達(dá)[3-4]。YAP與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF 6）相互作用，通過(guò)K48泛素化促進(jìn)TRAF 6的降解，抑制K63連接的泛素化，從而阻止核轉(zhuǎn)錄因子（NF） -κB的激活。Yi等[14]發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素通過(guò)激活巖石使YAP進(jìn)入ECs核團(tuán)并與

Egr-1結(jié)合。Song等[15]證明內(nèi)毒素可激活巨噬細(xì)胞/

肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞中的YAP與炎癥細(xì)胞因子啟動(dòng)子區(qū)的Tead結(jié)合，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，引起多個(gè)器官功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致感染加重和膿毒性休克的發(fā)生。

通過(guò)追蹤觀察膿毒癥患者28 d的臨床結(jié)局，我們發(fā)現(xiàn)死亡亞組與存活亞組外周血單個(gè)核細(xì)胞YAP mRNA和APACHE Ⅱ評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的Pearson相關(guān)分析顯示兩者呈正相關(guān)。APACHE Ⅱ是目前國(guó)際上公認(rèn)最權(quán)威、最實(shí)用、臨床應(yīng)用最為廣泛的急危重癥患者病情評(píng)估評(píng)分系統(tǒng)，隨著分值的升高，患者的病情越危重，死亡的風(fēng)險(xiǎn)越高，APACHE Ⅱ評(píng)分能夠較為全面地反映患者機(jī)體狀況和評(píng)估危重癥患者的預(yù)后[16]。本研究結(jié)果提示YAP的表達(dá)可能與患者預(yù)后有關(guān)，高YAP表達(dá)預(yù)示不良預(yù)后，患者的死亡可能性更大。ROC曲線分析結(jié)果也顯示YAP在膿毒癥患者預(yù)后方面具有較好的預(yù)測(cè)效能。

綜上所述，膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞YAP mRNA表達(dá)水平升高，YAP與膿毒癥患者病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后存在著一定的相關(guān)性，YAP有助于臨床上早期評(píng)估膿毒癥患者的預(yù)后，從而為治療提供參考，具有較好的臨床意義和推廣價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 陳偉棟，徐嘉，黃振華，古釬林，廖瑾莉，韋秋霞，詹紅. EPC、FMD與膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究.新醫(yī)學(xué)，2019，50（5） ：361- 365.

[2] Hu C， Sun J， Du J，Wen D， Lu H， Zhang H， Xue Y， Zhang A， Yang C， Zeng L， Jiang J. The hippo-YAP pathway regulates the proliferation of alveolar epithelial progenitors after acute lung injury. Cell Biol Int，2019，43（10）：1174-1183.

[3] 呂陽(yáng). Yes相關(guān)蛋白（YAP）在膿毒癥發(fā)病中的作用及其機(jī)制研究.南京：南京醫(yī)科大學(xué)，2018.

[4] Lv Y， Kim K， Sheng Y， Cho J， Qian Z， Zhao YY， Hu G， Pan D， Malik AB， Hu G. YAP controls endothelial activation and vascular inflammation through TRAF6. Circ Res， 2018， 123 （1）：43-56.

[5] Rhodes A， Evans LE， Alhazzani W，Levy MM， Antonelli M， Ferrer R， Kumar A， Sevransky JE， Sprung CL， Nunnally ME， Rochwerg B， Rubenfeld GD， Angus DC， Annane D， Beale RJ， Bellinghan GJ， Bernard GR， Chiche JD， Coopersmith C， De Backer DP， French CJ Fujishima S， Gerlach H， Hidalgo JL， Hollenberg SM， Jones AE， Karnad DR， Kleinpell RM， Koh Y， Lisboa TC， Machado FR， Marini JJ， Marshall JC， Mazuski JE， McIntyre LA， McLean AS， Mehta S， Moreno RP， Myburgh J， Navalesi P， Nishida O， Osborn TM， Perner A， Plunkett CM， Ranieri M， Schorr CA， Seckel MA， Seymour CW， Shieh L， Shukri KA， Simpson SQ， Singer M， Thompson BT， Townsend SR， Van der Poll T， Vincent JL， Wiersinga WJ， Zimmerman JL， Dellinger RP. Surviving sepsis campaign： international guidelines for management of sepsis and septic shock： 2016. Intensive Care Med， 2017，43（3）：304-377.

[6] 何問(wèn)理，溫海東，羅云.結(jié)石梗阻致尿源性膿毒血癥的影響因素及早期診治策略分析. 新醫(yī)學(xué)，2019，50（12）：928-932.

[7] Prescott HC， Angus DC. Postsepsis morbidity. JAMA， 2018， 319（1）：91.

[8] Van Soldt BJ， Cardoso WV. Hippo-Yap/Taz signaling：complex network interactions and impact in epithelial cell behavior. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol，2019，12（11）：e371.

[9] Hsu PC，Jablons DM，Yang CT，You L.Epidermal growth factor receptor （EGFR） pathway， yes-associated protein （YAP） and the regulation of programmed death-ligand 1 （PD-L1） in non-small cell lung cancer （NSCLC）.Int J MolSci， 2019，20（15）：E3821.

[10] Koo JH， Plouffe SW， Meng Z，Lee DH， Yang D， Lim DS， Wang CY， Guan KL. Induction of AP-1 by YAP/TAZ contributes to cell proliferation and organ growth. Genes Dev， 2019， 34（1-2）：72-86.

[11] Taha Z， JvR HJ， Yang X. The Hippo pathway：immunity and cancer. Cancers （Basel）， 2018， 10（4）：E94.

[12] 胡迎春，張千，鐘武，陳睦虎，周凱. YAP1基因在膿毒血癥大鼠中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究. 內(nèi)科急危重癥雜志， 2016， 22 （5）：377-379.

[13] 左文，王海清，鐘武，胡迎春，陳睦虎. YAP及P-YAP在RAW264.7細(xì)胞膿毒癥模型中的表達(dá).西部醫(yī)學(xué)，2018，30（4）：489-492.

[14] Yi L， Huang X， Guo F， Zhou Z， Dou Y， Huan J. Yes-associated protein （YAP） signaling regulates lipopolysaccharide-induced tissue factor expression in human endothelial cells.Surgery， 2016， 159（5）：1436-1448.

[15] Song K， Kwon H， Han C， Chen W， Zhang J， Ma W， Dash S， Gandhi CR， Wu T. Yes-associated protein in Kupffer cells enhances the production of pro-inflammatory cytokines and promotes the development of non-alcoholic steatohepatitis. Hepatology， 2019，10：30990

[16] Falc?o ALE， Barros AGA， Bezerra AAM， Ferreira NL， Logato CM， Silva FP， do Monte ABFO， Tonella RM， de Figueiredo LC， Moreno R， Dragosavac D， Andreollo NA. The prognostic accuracy evaluation of SAPS 3， SOFA and APACHEⅡ scores for mortality prediction in the surgical ICU： an external validation study and decision-making analysis. Ann Intensive Care， 2019， 9 （1）：18.

（收稿日期：2020-03-31）

（本文編輯：洪悅民）