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    高通量測(cè)序解析白酒中高溫大曲細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)

    2020-08-02 10:06:16馬歌麗王光路胡曉龍張治剛王永亮劉智勇李寶珍
    中國釀造 2020年6期

    楊 旭 ,馬歌麗,王光路,胡曉龍,張治剛,王永亮,劉智勇,李寶珍

    (1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.鄭州市代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450001;3.賈湖酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司,河南 漯河 462400;4.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 科技處,河南 鄭州 450001)

    近20年來,隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,不同香型白酒大曲中的微生物(主要是細(xì)菌和真菌)種群結(jié)構(gòu)及其組成得到有效解析,如所有香型白酒大曲中均鑒定出乳桿菌屬(Lactobacillus);濃香和醬香型白酒大曲中優(yōu)勢(shì)菌群為芽孢桿菌屬(Bacillus)[1-2];扣囊復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和總狀橫梗霉(Lichtheimia ramosa)在清香和濃香型白酒大曲中被檢測(cè)到;醬香型白酒大曲中特殊微生物為疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanugino sus)[3]。由于白酒釀造主要原料高粱中含有的淀粉不能被大多數(shù)酵母菌和細(xì)菌直接利用,需要通過絲狀真菌產(chǎn)生的α-淀粉酶和糖化酶水解為可發(fā)酵糖[4],所以真菌在大曲釀造過程中發(fā)揮重要作用。如成熟茅臺(tái)風(fēng)味大曲中檢測(cè)出多種真菌:曲霉屬(Aspergillus)、毛霉屬(Mucor)和根霉屬(Rhizopus),總狀毛霉(Mucor racemosus)和嗜熱子囊菌(Thermoascus crustaceus)[5-6]。微生物區(qū)系對(duì)成品大曲香氣的優(yōu)劣有著直接的影響[7]。然而,目前微生物群落結(jié)構(gòu)組成的研究大部分集中在濃香、醬香和清香型等主流白酒釀造過程,關(guān)于北方不同香型白酒大曲中微生物相關(guān)的研究還較少。

    高通量測(cè)序技術(shù)已被廣泛用于分析發(fā)酵食品(如白酒、葡萄酒、醋和醬油等)微生物群落的組成[8-10]。基于該技術(shù),本實(shí)驗(yàn)研究了賈湖白酒大曲發(fā)酵過程中理化性質(zhì)和微生物(細(xì)菌和真菌)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化;確定大曲樣品中細(xì)菌和真菌類群的相對(duì)豐度和多樣性,對(duì)鑒定和判斷大曲制曲過程相關(guān)的主要微生物、指導(dǎo)大曲生產(chǎn),具有重要的意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大曲樣品:河南漯河賈湖酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司曲房制作過程中的樣品曲,取樣點(diǎn)為入房(JH1)、第1次翻曲(JH2)、第2次翻曲(JH3)、第3次翻曲(JH4)、出房(JH5)5個(gè)點(diǎn)。每次取樣固定為同一點(diǎn),每次取樣3個(gè)曲塊,將樣品粉碎混合為一個(gè)區(qū)域的綜合樣(實(shí)驗(yàn)樣品),共獲取5個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)樣品。實(shí)驗(yàn)樣品迅速置于-20 ℃保藏備用。

    E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNA試劑盒:美國OMEGA公司;Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒:美國Life公司;2×TaqMaster Mix:南京諾唯贊生物科技有限公司;MagicPureSizeSelection DNA Beads:北京全式金生物有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Heraeus X1R臺(tái)式離心機(jī):Thermo Fisher公司;BE-1200漩渦混合器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;TND03-H-H混勻型干式恒溫器:深圳拓能達(dá)科技有限公司;DYY-6E型電泳儀電源,DYCP-31C型電泳槽:北京市六一儀器廠;Biodoc-IT凝膠成像系統(tǒng):美國UVP公司;Qubit3.0熒光計(jì):Invitrogen公司;T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀:美國BIO-RAD公司;Research plus 單道可調(diào)量程移液器:德國Eppendorf公司。

    1.3 方法

    1.3.1 大曲水分和酸度測(cè)定

    按照QB/T 4257—2011釀酒大曲通用分析方法測(cè)定大曲水分和酸度。

    1.3.2 脫氧核糖核酸提取

    稱取200 mg樣品,放入滅菌2 mL離心管中,加入1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇,振蕩混勻,室溫條件下10 000 r/min離心3 min,棄置上層液體。加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS),振蕩混勻,室溫條件下10 000 r/min離心3 min,棄置上層液體。倒置2 mL管于吸水紙上1 min,直至沒有液體流出。將樣品管放入55 ℃烘箱10 min,使殘留酒精完全揮發(fā),保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。脫氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid,DNA)具體提取步驟參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA試劑盒的使用說明書[11]。

    1.3.3 16S 核糖體核糖核酸和真菌種屬基因測(cè)序及序列分析

    16S核糖體核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid,rRNA)基因PCR擴(kuò)增所用的引物為已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物:

    341F 引 物:CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG

    805R 引 物:GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GACTACHVGGGTATCTAATCC

    PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s,25次循環(huán)后,72 ℃延伸5 min,10 ℃保持至停止。

    真菌種屬(internal transcribed spacer,ITS)PCR擴(kuò)增所用的引物為已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的ITS1-2通用引物:

    ITS1F 引 物:CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode)CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

    ITS2R引物:GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GCTGCGTTCTTCATCGATGC

    PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s,25次循環(huán)后,72 ℃延伸5 min,10 ℃保持至停止。

    PCR反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(2%)電泳檢測(cè)?;厥盏腄NA利用Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒精確定量,按照1∶1等量混合后測(cè)序。等量混合時(shí),每個(gè)樣品DNA量取10 ng,最終上機(jī)測(cè)序濃度為20 pmol。

    1.3.4 生物信息學(xué)分析

    Illumina MiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列[12],序列中含有barcode序列,以及測(cè)序時(shí)加入的引物和接頭序列。首先去除引物接頭序列,再根據(jù)雙末端(paired-end,PE)reads之間的overlap關(guān)系,將成對(duì)的reads拼接成一條序列,然后按照barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù),最后對(duì)各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾,得到各樣本的有效數(shù)據(jù)。采用軟件Usearch將所有樣本序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類,后根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)[13]。通常在97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。將獲得的每個(gè)OTU的代表序列與在線數(shù)據(jù)庫(ribosomal database project,RDP)[14]進(jìn)行比對(duì),篩選出OTU序列的最佳比對(duì)結(jié)果,并對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行過濾,默認(rèn)滿足相似度>90%且Coverage>90%的序列被用來后續(xù)分類[15],確定每個(gè)OTU的分類水平,即門、綱、目、科、屬、種水平。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大曲樣品水分和酸度變化

    大曲在制備過程中,由于溫度的變化,大曲水分含量逐漸降低,根據(jù)大曲質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定,大曲中的水分含量不能超過13%[16]。由圖1A可知,出房大曲(JH5)水分含量為8.38%(取樣時(shí)間為夏季,水分揮發(fā)較快)。大曲生產(chǎn)過程中由于水分低的關(guān)系生酸量低,常規(guī)酸度不會(huì)超過1.0。酸度主要是由產(chǎn)酸微生物在大曲中進(jìn)行有機(jī)酸代謝而形成,酸度大小可揭示大曲中產(chǎn)酸微生物的數(shù)量多寡,同時(shí)也歸因于大曲中脂肪酶和蛋白酶活力強(qiáng)弱[17]。由圖1B可知,大曲在入房時(shí)由于代謝旺盛,產(chǎn)酸最高,大曲JH1中酸度達(dá)到0.22 mmol/g。酸度的大小和微生物數(shù)量變化有很密切的關(guān)系,研究表明酸度大小與芽孢桿菌數(shù)量有正相關(guān)性[18]。本研究結(jié)果也證實(shí)該結(jié)論。在發(fā)酵期間,不同時(shí)間點(diǎn)大曲樣品芽孢桿菌屬相對(duì)豐度分別為2.90%、0.23%、0.10%、0.12%和0.18%,酸度也隨之降低和升高。所以,大曲生產(chǎn)過程中嚴(yán)格控制酸度有助于調(diào)控和平衡大曲中的微生物組成與數(shù)量,同時(shí)產(chǎn)生的有機(jī)酸還將與醇類化合物反應(yīng)產(chǎn)生濃郁的白酒風(fēng)味化合物[19-21]。

    圖2 大曲生產(chǎn)過程中水分(A)和酸度(B)變化Fig.2 Changes in water content and acidity during Daqu fermentation

    2.2 大曲微生物OTU多樣性

    本研究劃分細(xì)菌和真菌OTU 分類信息樣本文庫覆蓋率(Coverage指數(shù))都超過0.97,說明本次測(cè)序結(jié)果能代表樣本的真實(shí)情況,完全能夠反映該區(qū)域細(xì)菌和真菌群落的種類和結(jié)構(gòu)。由圖2可知,從大曲樣品入房到出房,細(xì)菌和真菌微生物多樣性指數(shù)(OUT值)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),并且都在曲溫達(dá)到頂溫時(shí)(大曲JH3)達(dá)到最高值。這也印證了整個(gè)培曲過程遵循“前緩、中挺、后緩落”的發(fā)酵規(guī)律[22],即大曲的培菌、生香轉(zhuǎn)化主要在40 ℃~60 ℃~40 ℃這一溫度變化區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,因而大曲中富集很多耐高溫微生物,而后續(xù)的真菌和細(xì)菌群落的詳細(xì)分析數(shù)據(jù)也驗(yàn)證了該結(jié)論。

    圖2 DNA測(cè)序法測(cè)定大曲操作分類單元數(shù)目Fig.2 Number of operational taxonomic units in Daqu determined by DNA sequencing

    2.3 大曲真菌群落ITS2 rRNA基因序列分析

    由圖3A可知,所有大曲樣品中的真菌種群共5個(gè)門:子囊菌門(Ascomycota)、毛霉亞門(Mucoromycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)和梳霉門(Kickxellomycota),其中子囊菌門在大曲JH1占主導(dǎo)地位(相對(duì)豐度74.03%)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,子囊菌門相對(duì)豐度逐漸減少,大曲JH3中減少到最低為26.94%,之后,又逐漸上升至大曲JH5中的47.38%。與之對(duì)應(yīng)的是毛霉亞門的此消彼長(zhǎng),由大曲JH1中的13.14%上升至大曲JH3中的71.47%,逐漸降低至大曲JH5中的36.28%。這可能是由于發(fā)酵過程中翻曲操作引起曲塊溫度的變化導(dǎo)致真菌結(jié)構(gòu)的演替:溫度升高有利于毛霉亞門類生長(zhǎng),而對(duì)子囊菌門類生長(zhǎng)和繁殖有阻礙作用。當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫階段(大曲JH3)時(shí),毛霉亞門類相對(duì)豐度達(dá)到最高,擔(dān)子菌門類相對(duì)豐度降至最低為0.14%,被孢霉門和梳霉門類已檢測(cè)不到,說明絕大多數(shù)微生物停止生長(zhǎng)。

    由圖3B可知,入房大曲JH1中假絲酵母屬(Candida),酵母屬(Saccharomycetales),根霉屬(Rhizopus)和曲霉屬(Aspergillus)是優(yōu)勢(shì)菌屬,其相對(duì)豐度占全部真菌群落的74.46%以上,其中最優(yōu)勢(shì)菌屬是假絲酵母屬,約占35.69%,假絲酵母屬是大曲發(fā)酵過程重要的真菌之一,主要產(chǎn)酒精和酯類物質(zhì)[23],而且大量產(chǎn)生酮類、烯類、酚類等揮發(fā)性化合物[24],對(duì)大曲品質(zhì)有著決定性的影響。由于入房時(shí)溫度較低,霉菌和酵母菌均大量生長(zhǎng),給大曲的多種功能打下基礎(chǔ)。隨著溫度升高,霉菌生長(zhǎng)越來越旺盛,其中毛霉屬(Rhizomucor)在大曲JH2、JH3中的相對(duì)豐度分別達(dá)到21.17%、29.63%,相比較于大曲JH1,同比增加了21.13%、29.59%。當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫時(shí),橫梗霉屬(Lichtheimiaceae)成為優(yōu)勢(shì)菌群,相對(duì)豐度達(dá)到40.60%。在出房大曲JH5中,毛霉屬重新占據(jù)優(yōu)勢(shì),相對(duì)豐度達(dá)到34.44%,其次是根霉屬和曲霉屬。霉菌被視為大曲糖化降解動(dòng)力的主要來源,為曲酒的釀造提供糖化力、液化力、蛋白質(zhì)分解能力及多種有機(jī)酸等物質(zhì)[25-26]。

    圖3 大曲樣品中真菌在門(A)和屬(B)分級(jí)水平上的種類和相對(duì)豐度Fig.3 Types and relative abundance of fungi in Daqu samples at phylum level (A) and genus level (B)

    2.3 大曲細(xì)菌群落16S rRNA基因序列分析

    由圖4A可知,所有大曲樣品中的細(xì)菌種群共37個(gè)門,其中厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)在大曲JH1占主導(dǎo)地位,其相對(duì)豐度占全部細(xì)菌群落的97.29%以上。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,厚壁菌門相對(duì)豐度逐漸增加,在大曲JH3中達(dá)到最高為87.27%,之后,又逐漸降低至大曲JH5中的67.97%。與之對(duì)應(yīng)的是變形菌門的此消彼長(zhǎng),由大曲JH1中的18.87%降低至大曲JH3中的1.86%,逐漸增加至大曲JH5中的18.87%。這可能是由于發(fā)酵過程中翻曲操作引起曲塊溫度的變化導(dǎo)致細(xì)菌結(jié)構(gòu)的演替:溫度升高有利于厚壁菌門類生長(zhǎng),而對(duì)變形菌門類生長(zhǎng)和繁殖有阻礙作用。當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫階段(大曲JH3)時(shí),厚壁菌門類相對(duì)豐度達(dá)到最高,變形菌門類相對(duì)豐度降至最低。

    由圖4B可知,入房大曲JH1中分別檢測(cè)到乳桿菌屬(Lactobacillus),魏斯氏菌屬(Weissella),葡萄球菌屬(Staphylococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、泛菌屬(Pantoea)和芽孢桿菌屬(Bacillus),其中最優(yōu)勢(shì)菌是乳桿菌屬,約占20.10%,乳桿菌屬是白酒生產(chǎn)中非常重要的微生物之一,在釀造過程中具有促進(jìn)美拉德反應(yīng)、促進(jìn)釀酒的發(fā)酵、維護(hù)與保持釀酒微生態(tài)環(huán)境等作用[27]。魏斯氏菌屬屬于乳酸細(xì)菌,分解葡萄糖產(chǎn)生CO2異型發(fā)酵產(chǎn)生乳酸,有利于乳酸乙酯的形成及酒質(zhì)的穩(wěn)定,是白酒釀造中的重要微生物之一[28]。當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫時(shí),高溫放線菌科克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)成為明顯優(yōu)勢(shì)菌群,相對(duì)豐度達(dá)到60.67%,乳桿菌屬降至最低為15.41%。高溫放線菌科克羅彭斯特菌的發(fā)現(xiàn)應(yīng)該屬于賈湖白酒大曲特殊微生物,結(jié)果說明高溫放線菌不單只存在于高溫大曲中,在中低溫大曲中同樣存在。該菌在醬香、濃香等主流香型白酒大曲中都未見報(bào)道,只在清香和芝麻香型白酒高溫大曲中被檢測(cè)出來[29-30],還可能是因?yàn)榭瓶肆_彭斯特菌在大曲發(fā)酵過程中生存時(shí)間較短,不易于取樣檢測(cè)。隨著溫度降低,在出房大曲JH5中,科克羅彭斯特菌屬豐度已經(jīng)降低至0.28%,而乳桿菌屬重新占據(jù)優(yōu)勢(shì),相對(duì)豐度達(dá)到31.89%。

    圖4 大曲樣品中細(xì)菌在門(A)和屬(B)分級(jí)水平上的種類和相對(duì)豐度Fig.4 Types and relative abundance of bacteria in Daqu samples at phylum level (A) and genus level (B)

    3 結(jié)論

    本研究分析了賈湖白酒大曲在整個(gè)發(fā)酵過程中的理化性質(zhì)以及真菌和細(xì)菌的組成。研究結(jié)果得到一個(gè)大曲數(shù)據(jù)庫,包含了5個(gè)不同發(fā)酵階段獲得的5個(gè)樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)。大曲樣品從入房到出房,細(xì)菌和真菌微生物多樣性指數(shù)(OTU值)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),并且都在曲溫達(dá)到頂溫時(shí)(大曲JH3)達(dá)到最高值。這也印證了整個(gè)培曲過程遵循“前緩、中挺、后緩落”的發(fā)酵規(guī)律,即大曲的培菌、生香轉(zhuǎn)化主要在40 ℃~60 ℃~40 ℃這一溫度變化區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。賈湖白酒大曲生產(chǎn)過程中發(fā)酵前期真菌主要有假絲酵母屬(Candida)、根霉屬(Rhizopus)和曲霉屬(Aspergillus),當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫時(shí),橫梗霉屬(Lichtheimiaceae)成為優(yōu)勢(shì)菌群,發(fā)酵后期以毛霉屬(Rhizomucor)和曲霉屬為主。賈湖白酒大曲入房和出房樣品中細(xì)菌組成變化不大,乳桿菌屬(Lactobacillus)在整個(gè)發(fā)酵過程中一直存在。在發(fā)酵期間,不同時(shí)間點(diǎn)大曲樣品芽孢桿菌屬相對(duì)豐度分別為2.90%,0.23%、0.10%、0.12%和0.18%,酸度也隨之降低和升高,表明大曲酸度大小與芽孢桿菌數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)性。當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫時(shí),高溫放線菌科克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)成為優(yōu)勢(shì)菌群,相對(duì)豐度達(dá)到60.67%,該菌屬微生物應(yīng)該屬于賈湖白酒大曲中特殊微生物之一。細(xì)菌和真菌成分的這種動(dòng)態(tài)變化是由大曲生產(chǎn)工藝過程翻曲操作和溫度變化引起的。由于整個(gè)發(fā)酵過程中未接種發(fā)酵劑,這種相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)菌和真菌結(jié)構(gòu)還可能與發(fā)酵環(huán)境有關(guān)。

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