自然發(fā)酵酸筍中乳酸菌的篩選鑒定及益生特性研究

孫 寧，雷敬玲，吳曉青，黃 麗，李 玲，黃子珍

（1.皇氏集團(tuán)華南乳品有限公司，廣西 南寧 530000；2.廣西水牛乳工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530000；3.廣西壯族自治區(qū)水牛乳質(zhì)量與安全控制技術(shù)工程研究中心，廣西 南寧 530001；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001）

酸筍以竹筍為主要原料，無(wú)鹽、低鹽或高鹽，經(jīng)過(guò)漂水排氣后密封自然發(fā)酵而成，是我國(guó)傳統(tǒng)特色的發(fā)酵蔬菜制品。其風(fēng)味獨(dú)特，富含膳食纖維和人體必需氨基酸，具有降血脂、增強(qiáng)免疫力等功效[1]。酸筍發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌起主導(dǎo)作用，豐富了發(fā)酵制品的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且改善人體腸道不適及增強(qiáng)結(jié)腸功能與穩(wěn)定性，是篩選益生菌的來(lái)源。

目前，主要集中于對(duì)酸筍產(chǎn)品和發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群的研究，周金沙等[2]應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)并通過(guò)生物信息統(tǒng)計(jì)與分析發(fā)現(xiàn)，廣西無(wú)鹽發(fā)酵酸筍樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）。夏雪娟等[3-4]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reactiondenaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)監(jiān)控腌制麻竹筍的發(fā)酵過(guò)程中微生物區(qū)系變化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵7 d后優(yōu)勢(shì)菌為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。同時(shí)，還研究了腌制大葉麻竹筍發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌乳酸乳球菌含量的變化發(fā)現(xiàn)，在腌制0～63 d過(guò)程中，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）含量在14 d時(shí)達(dá)到最大值，與0 d相比增加了6個(gè)數(shù)量級(jí)。鄭炯等[5]也采用PCR-DGGE對(duì)2種腌制麻竹筍的微生物區(qū)系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，低鹽腌制筍的優(yōu)勢(shì)菌多為益生菌，如乳球菌屬（Lactococcussp.）和魏斯氏菌屬（Weissellasp.），而高鹽腌制筍的優(yōu)勢(shì)菌多為抗性較強(qiáng)的菌，除了益生菌，還有腐敗菌如綠色氣球菌（Aerococcus viridans）和芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。SINGHAL P等[6]從印度東北部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵竹筍中分離得到13株菌，其中8株均為乳桿菌屬。而對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸筍乳酸菌的研究較少。

本研究擬從廣西自然無(wú)鹽發(fā)酵酸筍中篩選益生特性較強(qiáng)的乳酸菌，并對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定及特性研究，為后續(xù)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用優(yōu)良發(fā)酵劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酸筍樣品

自然發(fā)酵酸筍：采集于廣西南寧市，包括中堯菜市3份（ZR1、ZR2、ZR3）、新村菜市3份（XC1、XC2、XC3），自制2份（Z1、Z2），采用無(wú)菌瓶收集，放置于4 ℃冷藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、1,1-二 苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picylhydrazyl，free radical，DPPH）（均為分析純）：美國(guó)Sigma Aldrich公司；凝膠瓊脂（分析純）：上海玉博科技有限公司；DL 2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：美國(guó)Takaba Clontech公司；Chelex-100純化DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)菌通用引物27f、1492r：蘇州金唯智生物科技有限公司；2×Es TaqMasterMix（含染料）：康為世紀(jì)生物科技有限公司；氯化鈉、碳酸鈣、氫氧化鈉、濃鹽酸、鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市博迪化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氯乙酸、鄰二氮菲（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）：江蘇綠葉生物科技有限公司；牛膽鹽（分析純）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；無(wú)菌脫纖維羊血：青島海博生物技術(shù)有限公司。

人工胃液[7]：NaCl 0.8 g、KH2PO40.02 g、Na2HPO40.115 g、胃蛋白酶0.35 g、蒸餾水100 mL，用1 mol/L HCl調(diào)整pH為2.5，使用0.22 μm濾菌器過(guò)濾除菌，備用。

人工腸液[7]：NaCl 0.8 g、KH2PO40.02 g、Na2HPO40.115 g、胰蛋白酶0.1 g、牛膽鹽1.8 g、蒸餾水100 mL，使用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，使用0.22 μm 濾菌器過(guò)濾除菌，備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biotek Epoch2微孔板分光光度計(jì)：美國(guó)伯騰儀器有限公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PB-10 pH計(jì)：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YM 50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)、LP Vortex Mixer旋渦振蕩器：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；DYY-6D型電泳儀：北京市六一儀器廠；BIO-RAD C1000 Touch cthemal聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；Ose-470p便攜式藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng)：天根生化科技（北京）有限公司；ME204E分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；C21-SDHCB39電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

將樣品用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋后的樣品分別均勻涂布于含1.6%溴甲酚紫或2%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h。挑選溴甲酚紫平板變黃和有溶鈣圈的單菌落在平板上劃線分離反復(fù)純化。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

形態(tài)觀察：對(duì)分離純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色和接觸酶實(shí)驗(yàn)。革蘭氏染色陽(yáng)性、接觸酶實(shí)驗(yàn)為陰性的菌株可初步判定為乳酸菌。

分子生物學(xué)鑒定：采用Chelex-100純化DNA提取試劑盒[8]提取分離菌株的基因組DNA，以其為模板，采用WALSH P S等[9]的方法對(duì)分離菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR梯度擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Ose-470p便攜式藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng)成像，委托上海美吉生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交至EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)[10]及美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Gen-Bank數(shù)據(jù)中進(jìn)行在線比對(duì)。

1.3.3 具有潛在益生特性乳酸菌的初篩

（1）供試菌液的制備

將待測(cè)乳酸菌凍存菌液100 μL接種于6 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。按2%（V/V）的接種量將種子液接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，活化至3代，使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）調(diào)菌體濃度為1.0×108CFU/mL。

（2）溶血性實(shí)驗(yàn)[11]

將供試菌液劃線于含有5%脫纖維羊血的血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察平板上菌落生成情況。

（3）耐酸性實(shí)驗(yàn)[7]

將供試菌液以2%（V/V）的接種量分別接種于pH值為2.0、2.5、3.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察平板上是否有菌落生成。

（4）膽鹽耐受性實(shí)驗(yàn)[7]

將供試菌液以2%（V/V）的接種量接種于含有0.3%牛膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基中，同時(shí)將供試菌液涂布于含有0.3%牛膽鹽的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定其發(fā)酵液在波長(zhǎng)630 nm處的吸光度值，并觀察固體平板上是否有菌落生成。

（5）模擬人工胃液耐受性試驗(yàn)[7]

選取γ型溶血、耐pH 2.0和0.3%膽鹽的乳酸菌，取0.5 mL供試菌液與4.5 mL pH 2.5的人工胃液混勻后，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別在0 h和3 h取樣0.2 mL，以2%（V/V）的接種量涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察平板上是否有菌落生成。

（6）模擬人工腸液耐受性試驗(yàn)[7]

選取γ型溶血、耐pH 2.0和0.3%膽鹽的乳酸菌，取0.5 mL供試菌液與4.5 mL模擬人工胃液混勻，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)3 h后，從中吸取0.5 mL發(fā)酵菌液加入4.5 mL模擬人工腸液混勻，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別取0 h和6 h菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察平板上是否有菌落生成。

1.3.4 乳酸菌的體外抗氧化能力測(cè)定

供試菌液在4 ℃條件下經(jīng)8 000 r/min離心30 min，收集發(fā)酵上清液，即為胞外分泌物，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，參照文獻(xiàn)[12]測(cè)定DPPH自由基清除能力；參照文獻(xiàn)[13]測(cè)定ABTS自由基清除能力；參考文獻(xiàn)[14]測(cè)定還原力。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBMSPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Duncan進(jìn)行單因素方差分析，通過(guò)DNA Star軟件進(jìn)行序列整理，每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從廣西南寧市8種不同來(lái)源的自然發(fā)酵酸筍中分離得到69株菌，革蘭氏染色均為陽(yáng)性，接觸酶反應(yīng)均為陰性，因此，初步鑒定這69株菌為乳酸菌，其中菌株ZR1-20及ZR3-01的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。由圖1可知，兩株菌株的菌落表面微凸、半透明、光滑、圓形、直徑為0.5～3.5 mm，菌株ZR1-20細(xì)胞呈桿狀，菌株ZR3-01細(xì)胞呈球狀。

圖1 部分乳酸菌的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony morphology and cell morphology of some lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)分離得到的69株疑似乳酸菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，部分菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 部分乳酸菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products of some lactic acid bacteria

由圖2可知，均得到約1 500 bp的目標(biāo)條帶，且電泳帶光亮明顯，證明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)雜質(zhì)可進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)在線相似性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乳酸菌16S rDNA序列相似性比對(duì)結(jié)果Table 1 Comparison results of 16S rDNA sequences similarity of lactic acid bacteria

由表1可知，32株、26株、6株和2株菌株分別與Lactobacillus brevis（ATCC14869）、Lactobacillus alimentarius（DSM20249）、Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum（ATCC14917）和Streptococcus lutetiensis（CIP106849）相似性在97.88%～100.00%，分別占分離乳酸菌總數(shù)的46.38%、38.68%、8.70%和2.90%。菌株XC3-01、XC3-02和Z1-06分別與Pediococcus pentosaceus（DSM2033）、Lactobacillus pentosus（DSM20314）、Streptococcus anginosussubsp.whileyi（CCUG39159）的相似度均≥99.74。因此，鑒定69株菌株隸屬于2個(gè)科3個(gè)屬，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）。周金沙等[2]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)鹽自然發(fā)酵酸筍中的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lacto-coccus）和魏斯氏菌屬（Weissella），與本研究結(jié)果部分相似。

2.3 溶血實(shí)驗(yàn)

溶血是指細(xì)菌分泌的溶血素使細(xì)胞溶解的現(xiàn)象，與菌株自身致病性相關(guān)，是評(píng)價(jià)益生菌安全性的先決條件[11，15]。在益生菌篩選中，γ-溶血是指菌落周圍顯示正常血平板顏色，對(duì)溶血沒(méi)有副作用，可作為益生菌候選菌株；α-溶血是指在血平板上菌落周圍呈現(xiàn)草綠色，為潛在性致病菌；β-溶血是指菌落周圍出現(xiàn)無(wú)色透明圈，為強(qiáng)致病性，不宜作為益生菌[16-18]。本研究對(duì)69株乳酸菌進(jìn)行溶血活性檢測(cè)，在血平板上菌落周圍均未出現(xiàn)透明圈和綠色，均為γ-溶血，說(shuō)明沒(méi)有引起溶血現(xiàn)象，能用于益生菌研究。

2.4 乳酸菌的耐受性

表2 69株乳酸菌的耐酸性及耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of acid tolerance and bile salt tolerance tests of 69 strains of lactic acid bacteria

續(xù)表

食物在胃中消化1～2 h，在此期間以活菌方式順利通過(guò)人體胃腸道是乳酸菌成為益生菌的前提，胃液中胃蛋白酶能分解菌體細(xì)胞，胃酸pH值約為1.5～3.0，一般維持在3.0，此條件下能抑制或殺死細(xì)菌，因此，低pH環(huán)境下具有耐受性的乳酸菌才能在胃酸中存活，后續(xù)到達(dá)腸道[19]。由表2可知，能在pH 3.0、pH 2.5和pH 2.0酸性條件下生長(zhǎng)的乳酸菌分別有69株、60株和41株，分別占比100%、86.96%和59.42%，說(shuō)明酸筍中分離的乳酸菌耐酸特性較好。

人體腸液中胰蛋白酶能水解菌體蛋白質(zhì)；膽汁中膽鹽是人體干細(xì)胞分泌膽汁酸和牛磺酸或甘氨酸結(jié)合得到的鈉鹽或鉀鹽，其濃度為0.03%～0.3%，在人體小腸中能夠影響菌體細(xì)胞膜的通透性，受兩者的抑制作用，乳酸菌存活力降低，因此也需對(duì)腸液具有一定耐受性，以利于在腸道中定植[20-22]。由表2可知，在0.3%膽鹽的條件下，69株乳酸菌的OD630nm值均≥1.488，平板結(jié)果顯示菌株布滿整個(gè)培養(yǎng)基，說(shuō)明在0.3%膽鹽的條件下69株乳酸菌生長(zhǎng)非常好，均具有較強(qiáng)的耐受性。

從同時(shí)屬于γ-溶血、耐pH 2.0和耐0.3%膽鹽的41株乳酸菌中選取17株進(jìn)行模擬人工胃腸液耐受性試驗(yàn)。結(jié)果表明，17株菌株在MRS平板上均長(zhǎng)勢(shì)良好，說(shuō)明17株乳酸菌對(duì)人工胃腸液耐受性很好，將用于抗氧化能力的研究。

2.5 乳酸菌的體外抗氧化能力

2.5.1 乳酸菌胞外分泌物對(duì)DPPH自由基的清除能力

由表3可知，17株菌株都表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力，清除能力較強(qiáng)且差異較大，清除率為49.90%～76.47%。其中短乳桿菌Z1-02具有最強(qiáng)的DPPH自由基清除率，為（76.47±1.18）%，顯著強(qiáng)于其余乳酸菌（P＜0.05）。消化乳桿菌ZR1-05和3株短乳桿菌ZR2-14、ZR2-12、ZR2-22的DPPH自由基清除率均＞70%，具有較理想的DPPH自由基清除能力。乳酸菌產(chǎn)生胞外多糖，一部分是附著于菌體表面，另一部分是分泌到菌體細(xì)胞外，與其DPPH自由基清除活性相關(guān)[23]。本試驗(yàn)17株菌株胞外分必物對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，說(shuō)明其均可能會(huì)產(chǎn)生胞外多糖。

表3 乳酸菌胞外分泌物對(duì)DPPH自由基的清除率Table 3 DPPH free radical scavenging rate of extracellular secretions of lactic acid bacteria

2.5.2 乳酸菌胞外分泌物對(duì)ABTS自由基的清除能力

表4 乳酸菌胞外分泌物對(duì)ABTS自由基的清除率Table 4 ABTS free radical scavenging rate of extracellular secretions of lactic acid bacteria

由表4可知，17株乳酸菌均對(duì)ABTS自由基具有較強(qiáng)的清除能力，稀釋10倍后胞外分泌物的ABTS自由基清除率為57.50%～90.37%，與DPPH自由基一樣，其中短乳桿菌Z1-02具有最強(qiáng)的ABTS自由基清除率，為（90.37±0.29）%，顯著強(qiáng)于其余乳酸菌（P＜0.05），另外短乳桿菌ZR2-22、2株消化乳桿菌ZR1-05和ZR1-17的ABTS自由基清除率均＞85%，清除自由基效果均較高。

2.5.3 乳酸菌胞外分泌物的還原能力

表5 乳酸菌胞外分泌物的還原能力Table 5 Reducing power of extracellular secretions of lactic acid bacteria

由表5可知，17株乳酸菌胞外分泌物均具有較高的還原能力，菌株胞外分泌物5倍稀釋液的A700nm值范圍在0.284～0.552，其中菌株Z1-02、ZR1-05、ZR1-02、XC2-01、ZR2-12、ZR2-22表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力，吸光度值（A700nm值）均＞0.480。與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率一樣，短乳桿菌Z1-02還原能力最高。

3 結(jié)論

本研究從廣西自然發(fā)酵酸筍中篩選出69株乳酸菌，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA序列分析鑒定其隸屬于2個(gè)科3個(gè)屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）。69株乳酸菌均為γ-溶血安全菌株，且均對(duì)0.3%膽鹽具有良好的耐受性。其中，41株乳酸菌耐pH 2.0酸性條件，且從中優(yōu)選出的17株乳酸菌對(duì)人工胃腸液均有良好的耐受性。17株乳酸菌中4株短乳桿菌（Z1-02、ZR2-14、ZR2-12、ZR2-22）和2株消化乳桿菌（ZR1-02、ZR1-05）對(duì)DPPH自由基及ABTS自由基的清除率、還原能力分別＞62%、79%、0.393，其中乳桿菌Z1-02的綜合抗氧化能力最強(qiáng)。結(jié)果表明，這6株乳酸菌具備優(yōu)良的體外抗氧化活性和益生性能，可用于后續(xù)乳酸菌的菌種選育，是研制功能性抗氧化食品發(fā)酵劑以及開(kāi)發(fā)新型益生活菌制劑的理想菌株。