傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜中降解亞硝酸鹽腸膜明串珠菌的分離鑒定及特性分析

劉笑笑，金永梅，吳 迪，王 瑩，魏春雁

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130033；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（長春），吉林 長春 130033）

泡菜是一類有著悠久歷史的傳統(tǒng)食品，按產(chǎn)地及口味主要分為中國泡菜、韓國泡菜和日本泡菜，日本泡菜屬于非發(fā)酵型，中國泡菜和韓國泡菜屬于發(fā)酵型[1]。朝鮮族泡菜是極具民族特色的中國泡菜之一，種類繁多，各具獨特的風(fēng)味且富含乳酸菌和乳酸[2]。櫻菜是朝鮮族人種植的特色蔬菜，營養(yǎng)豐富，味道適合大眾口味，但生長期短且具有季節(jié)性，因此，將其制成朝鮮族泡菜，提高了其營養(yǎng)價值和貯藏性[3]。

朝鮮族泡菜是一種風(fēng)味獨特的乳酸發(fā)酵蔬菜制品，富含活性乳酸菌，可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。部分學(xué)者已對朝鮮族泡菜中的微生物進行了研究，孟令帥等[4]從25份朝鮮族家庭制作的傳統(tǒng)發(fā)酵辣白菜中分離出81株乳酸菌，其中34株桿菌、47株球菌，歸屬于2個屬6個種，45株屎腸球菌（Enterococcus faecium）、25 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、4株干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、3株戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、2株短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、2株堅強腸球菌（Enterococcus durans）；劉長蕾等[5]對朝鮮族辣白菜發(fā)酵過程中微生物變化進行了研究，結(jié)果表明，明串珠菌（Leuconostoc）是發(fā)酵蔬菜食品發(fā)酵初期的優(yōu)勢菌，發(fā)酵至8 d時明串珠菌數(shù)量達到最高，發(fā)酵20 d后，檢測不到明串珠菌。目前對朝鮮族泡菜的研究集中于朝鮮族辣白菜，對傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜的研究報道甚少。此外，朝鮮族泡菜制作簡便、成本低廉、食用方便，但發(fā)酵過程中存在著食用安全的問題，最值得關(guān)注的就是亞硝酸鹽，因此，分離降解亞硝酸鹽的菌株很有必要。

腸膜明串珠菌是乳酸菌中明串珠菌屬（Leuconostocsp.）的重要菌種[6-8]，是自然發(fā)酵食品中的優(yōu)勢細菌[9]。對人和動物均無毒性和致病作用，尤其是腸膜明串珠菌腸膜亞種已被我國衛(wèi)生部（2012年第8號公告）與美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）列為可食用菌種之一[10]。腸膜明串珠菌具有促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，改善產(chǎn)品風(fēng)味，同時具有抗氧化能力和拮抗致病菌能力[11-12]。因其能夠產(chǎn)生特殊風(fēng)味物質(zhì)，在乳和泡菜等食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[3，13-14]。

本研究從具有民族特色的延邊朝鮮族地區(qū)采集24份傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜，從中分離篩選具有降解亞硝酸鹽功能的腸膜明串珠菌，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗和16S rDNA基因序列分析進行鑒定，并對其生長特性、產(chǎn)酸特性、耐鹽特性和耐酸堿特性進行研究。旨在為進一步研究其生理功能和開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

24份傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜分別取自延邊朝鮮族自治州金剛山泡菜專賣店、農(nóng)貿(mào)市場和超市，取樣時間為2017年4月9日。

1.1.2 主要試劑

亞硝酸鈉（分析純）：昆山東南化工材料有限公司；氯化鈉（分析純）：東莞市聚鵬化學(xué)有限公司；1%萬古霉素（分析純）：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；扁桃苷、熊果糖、水楊苷、赤蘚醇（均為優(yōu)級純）：上海麥克林生化科技有限公司；甘露糖（優(yōu)級純）：德國MERCK公司；L-鼠李糖（分析純）：上海化學(xué)試劑總廠試劑二廠；半乳糖、山梨醇、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、D-木糖、棉子糖、L-山梨糖、蜜二糖（均為優(yōu)級純）：美國Sigma公司；Ezup柱式細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

最低必需培養(yǎng)基（lowest minimal medium，LMM）、MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PRESOCLAVE-Ⅱ高壓滅菌器：西班牙SELECTA公司；2720 thermal cycler聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Applied Biosystems公司；HC-2518R冷凍高速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；CX41-RF熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 腸膜明串珠菌的分離與純化

無菌條件下，取延邊朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜汁1 mL涂布于LMM固體培養(yǎng)基，28 ℃倒置恒溫有氧培養(yǎng)48～72 h。挑取周圍產(chǎn)生水滴狀粘稠性多糖的菌落，在含有30 μg/mL萬古霉素的MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離純化2～3次。挑取單菌落，經(jīng)鏡檢，確認獲得單一菌種。

1.3.2 降解亞硝酸鹽菌株的篩選

以不加亞硝酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，取分離的菌株，以3%（V/V）的接種量分別接種于含質(zhì)量濃度為150 μg/mL亞硝酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，采用鹽酸萘乙二胺法[15]測定菌液中亞硝酸鹽含量，并計算亞硝酸鹽降解率，其計算公式如下：

式中：X為亞硝酸鹽降解率，%；Y為亞硝酸鈉初始含量，mg/kg；Y1為發(fā)酵后亞硝酸鈉含量，mg/kg。

選篩亞硝酸鹽降解率＞50%以上的菌株。

1.3.3 降解亞硝酸鹽菌株的鑒定

（1）形態(tài)觀察及生理生化試驗[16-18]

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[17]和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[18]的方法對篩選菌株進行形態(tài)觀察及生理生化鑒定。生理生化試驗項目包括37 ℃生長試驗、1 ℃生長試驗、過氧化氫酶試驗、耐鹽性試驗、精氨酸水解試驗、葡聚糖生成試驗、檸檬酸利用試驗、七葉苷水解試驗和碳水化合物發(fā)酵試驗。

（2）分子生物學(xué)鑒定

采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板，選用16S rRNA通用引物進行PCR擴增[19-20]，正向引物為7F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；反向引物為1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR擴增體系：基因組DNA（20～50 ng/μL）0.5 μL、10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL、TakaraTaq酶0.2 μL、引物7F0.5μL、引物1540R0.5μL、加雙蒸水（ddH2O）至25μL。

PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

PCR擴增結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，選取堿基長度為1 500 bp處亮度和長度適宜的條帶，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）檢索，選取序列同源性最高的已知菌種的16S rRNA序列，采用MEGA軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

1.3.4 降解亞硝酸鹽菌株生長特性研究

最適生長溫度的測定：取活化的篩選菌株，以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別置于25 ℃、28 ℃、30 ℃和36 ℃培養(yǎng)48 h，采用分光光度計在波長600 nm處測定其吸光度值（OD600nm值）。

生長曲線的測定：以不接菌的MRS液體培養(yǎng)基為空白對照。將活化好的篩選菌株以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，采用分光光度計測定其在波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。

產(chǎn)酸能力的測定：以不接菌的MRS液體培養(yǎng)基為空白對照。將活化好的篩選菌株，以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測定其pH值。

耐鹽性能的測定：取活化的篩選菌株，以2%（V/V）的接種量分別接種于含0、4%、6%、8%和10% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，采用分光光度計測定其在波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。

耐酸堿性能的測定：以不接菌的MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，將活化好的篩選菌株以2%（V/V）的接種量分別接種于初始pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，采用分光光度計測定其在波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS Statistics 17.0和Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸膜明串珠菌的分離與純化

通過LMM培養(yǎng)基分離，從24份傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜中共分離出20株帶有水滴狀粘稠性多糖的菌落；其中17株能在含30 μg/mL萬古霉素的MRS固體培養(yǎng)基上生長。

2.2 降解亞硝酸鹽菌株的篩選

測定分離得到的17株菌株的亞硝酸鹽降解能力，亞硝酸鹽降解率見圖1。

圖1 17株菌株的亞硝酸鹽降解能力Fig.1 Nitrite degradation capacity of 17 strains

由圖1可知，菌株JNZB003、JNZB005、JNZB009 和JNZB015的亞硝酸鹽降解率均＞50%，分別為95.92%、88.36%、52.71%、61.62%。

2.3 降解亞硝酸鹽菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征

4株具有降解亞硝酸功能的菌株中，菌株JNZB003在LMM培養(yǎng)基和含30 μg/mL萬古霉素的MRS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖2，4株菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果圖3。

圖2 菌株JNZB003在LMM培養(yǎng)基（a）和含30 μg/mL萬古霉素MRS固體培養(yǎng)基（b）上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain JNZB003 on LMM medium (a) and MRS solid medium with vancomycin 30 μg/ml (b)

圖3 篩選菌株的革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 Gram staining results of screened strains

由圖2可知，菌株JNZB003在LMM培養(yǎng)基上呈水滴狀菌落，在30 μg/mL萬古霉素MRS培養(yǎng)基上，菌落呈圓形、乳白色、表面光滑，其他菌株菌落形態(tài)相似。由圖3可知，4株菌株均為革蘭氏陽性菌，細胞形態(tài)呈球形和短桿形，成對或成短鏈排列。

2.3.2 生理生化試驗

將4株具有降解亞硝酸鹽功能的菌株進行生理生化試驗，結(jié)果見表1～表2。

表1 篩選菌株生理特性鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of physiological characteristics of screened strains

由表1可知，4株菌株均對30 μg/mL萬古霉素具有耐受性，過氧化氫酶陰性，1 ℃條件下均不生長，37 ℃條件下均生長；在3%和6.5%氯化鈉溶液中不同程度生長，其中菌株JNZB003、JNZB009和JNZB015在3%和6.5%氯化鈉溶液中生長良好，菌株JNZB005在3%氯化鈉生長良好，但在6.5%氯化鈉溶液中微弱生長。

表2 篩選菌株生化特性鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of biochemical characteristics of screened strains

由表2可知，4株菌株精氨酸水解試驗均為陽性反應(yīng)；菌株JNZB003和JNZB009能夠代謝檸檬酸，而菌株JNZB005和JNZB015不能代謝檸檬酸；菌株JNZB003和JNZB015能水解七葉苷，而菌株JNZB005和JNZB009不能水解七葉苷；菌株JNZB003、JNZB005和JNZB009能生成葡聚糖，而菌株JNZB015不能生成葡聚糖。

表3 篩選菌株的碳源利用試驗結(jié)果Table 3 Results of carbon source utilizing tests of screened strains

由表3可知，4株菌株都可以利用纖維二糖、蜜二糖、蔗糖、果糖、熊果糖、海藻糖、甘露糖、水楊苷、扁桃苷；都不能利用赤蘚醇、山梨醇、L-山梨糖和L-鼠李糖；此外，菌株JNZB003可以利用半乳糖、麥芽糖、D-木糖、棉子糖、L-阿拉伯糖和核糖；菌株JNZB005可以利用D-木糖和L-阿拉伯糖；菌株JNZB009可以利用半乳糖、麥芽糖、L-阿拉伯糖和D-木糖。

根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》中對明串珠菌屬的描述，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性試驗，初步判斷4株菌株均為明串珠菌屬（Leuconostocsp.）。

2.3.3 菌株的16S rRNA基因序列分析

在形態(tài)學(xué)特征和生理生化試驗基礎(chǔ)上，對篩選的4株菌株進行16S rRNA序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。以提取的4株菌株基因組為模板，利用16S rRNA通用引物，分別擴增出1.5 kb的目的片段。通過PCR產(chǎn)物純化、克隆、測序，獲得4株菌株的近乎全長16S rRNA 基因片段。通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST檢索，選取序列同源性最高的已知菌種的16S rRNA序列，采用MEGA軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4 基于16S rRNA基因序列4株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 4 strains based on 16S rDNA gene sequences

由圖4可知，4株菌株均屬于明串珠菌屬（Leuconostocsp.）。其中菌株JNZB003與腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）親緣關(guān)系最近；菌株JNZB005和JNZB009與冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum）親緣關(guān)系最近；菌株JNZB015與肉明串珠菌（Leuconostoc carnosum）親緣關(guān)系最近。

綜上，綜合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析，將菌株JNZB003鑒定為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），菌株JNZB005、JNZB009鑒定為冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum），菌株JNZB015鑒定為肉明串珠菌（Leuconostoc carnosum）。

2.4 腸膜明串珠菌JNZB003的生長特性分析

同種微生物因來源不同，在某些特性上存在一定的差異。因此，對既具有民族地方特色又是新菌源分離的腸膜明串珠菌JNZB003的生長特性進行分析，結(jié)果見圖5。

圖5 腸膜明串珠菌JNZB003的生長特性Fig.5 Growth characteristic of Leuconostoc mesenteroides JNZB003

由圖5A可知，腸膜明串珠菌JNZB003的生長溫度范圍較寬，在25～30 ℃范圍內(nèi)均能良好生長，最適生長溫度為30 ℃。

由圖5B可知，隨著NaCl含量的增加，腸膜明串珠菌JNZB003生長能力逐漸減弱，當NaCl含量為8%時，菌株生長緩慢，當NaCl含量達到10%時，菌株微弱生長。朝鮮族泡菜含鹽量一般在8%～10%，表明此菌在這個環(huán)境條件下有活性。

由圖5C可知，腸膜明串珠菌JNZB003具有良好的生長特性，培養(yǎng)0～6 h，為遲滯期；培養(yǎng)6～14 h，為對數(shù)期；培養(yǎng)14 h后進入穩(wěn)定期，此時OD600nm值達到1.52；培養(yǎng)48 h時，OD600nm值最高，達1.91，之后OD600nm值開始緩慢降低，進入衰減期。

由圖5D可知，腸膜明串珠菌JNZB003產(chǎn)酸較快，培養(yǎng)12 h時，pH值降至4.60；培養(yǎng)24 h時，pH值降至4.16；培養(yǎng)28 h時，pH值降至3.98；培養(yǎng)28 h后，pH趨于穩(wěn)定。產(chǎn)酸快，影響發(fā)酵程度及產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)，且能抑制雜菌生長。

由圖5E可知，腸膜明串珠菌JNZB003的最適生長pH值為6.0。當pH值＜4.0和pH值＞10.0時，菌株生長緩慢；當pH值為2.0和11.0時，菌株也能微弱生長，說明此菌耐酸堿性能較好。

3 結(jié)論

本研究從具有民族特色的延邊朝鮮族地區(qū)采集24份傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜，從中分離篩選出4株具有降解亞硝酸鹽功能的疑似腸膜明串珠菌。通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗和16S rRNA序列分析鑒定菌株JNZB003為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），菌株JNZB005、JNZB009為冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum），菌株JNZB015為肉明串珠菌（Leuconostoc carnosum）。腸膜明串珠菌JNZB003在含150 μg/mL亞硝酸鹽的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h時，亞硝酸鹽降解率高達95.92%，其最適生長溫度為30 ℃，最適生長pH值為6.0，培養(yǎng)14 h生長進入穩(wěn)定期，培養(yǎng)12 h pH值降至4.60，當NaCl含量為8%和pH值為3～10時，能夠生長，具有良好的降解亞硝酸鹽能力、生長特性、產(chǎn)酸能力，且耐鹽和耐酸堿。