糖型與淀粉型木薯后代塊根品質(zhì)與發(fā)酵特性

于博涵，韓冰瑩，朱作言，王文泉，張家明

（1.南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，江蘇 南京 210059；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室 海南省熱帶生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，海南 海口 571101）

燃料乙醇的發(fā)展原則為“不與人爭糧，不與糧爭地”[1-2]。木薯（Manihot esculentaCrantz）原產(chǎn)巴西，是大戟科木薯屬雙子葉植物，世界三大薯類（馬鈴薯、木薯、紅薯）之一，在全世界熱帶地區(qū)均有種植[3]。與甘蔗、玉米和小麥相比，木薯具有耐旱耐貧瘠、產(chǎn)量高、病蟲害少、淀粉含量高等優(yōu)良生物特性[4]，是熱帶干旱和半干旱國家和地區(qū)約7.5億人的主要糧食作物[5]。我國以廣東、廣西、海南種植較多，主要用于飼料和淀粉工業(yè)，其中約30%的鮮木薯被用作飼料，70%被用來加工淀粉和酒精[6]，因此，在我國木薯屬于非主糧作物[7]。以木薯為原料生產(chǎn)酒精和燃料乙醇有單位面積酒精產(chǎn)量高、不與糧爭地、符合國家產(chǎn)業(yè)發(fā)展政策等獨特優(yōu)勢，是最經(jīng)濟最適合的非糧燃料乙醇生產(chǎn)原料[8]。

我國木薯種植面積約30萬hm2，年產(chǎn)鮮薯500萬t，約占世界產(chǎn)量的1.8%[9]。我國用于制備酒精的木薯原料主要是自產(chǎn)的鮮木薯或木薯干。由于鮮木薯保鮮時間不長，以木薯干片為原料生產(chǎn)酒精可以確保周年生產(chǎn)。不過，在收獲季節(jié)，木薯酒精廠一般以鮮木薯為原料生產(chǎn)酒精，可以節(jié)省原料成本[10]。

乙醇生產(chǎn)是高耗能產(chǎn)業(yè)，其原因很大程度上是發(fā)酵醪濃度低，成熟發(fā)酵醪酒精度一般在8%vol左右。通過預(yù)處理工藝提高木薯發(fā)酵醪的初始總糖濃度，進行濃醪發(fā)酵，可以提高酒度。李克林等[11]利用α-淀粉酶預(yù)處理鮮木薯漿，將其液化，然后將鮮木薯和液化濾液按1.0∶1.2的比例混合，獲得初始總糖濃度在22%以上的木薯漿，再進行濃醪發(fā)酵，成熟醪酒度達到13.1%vol。但也有研究表明[12]，發(fā)酵初期總糖濃度過高會抑制酵母生長及其發(fā)酵作用。另外，利用優(yōu)良的木薯品種作為原料生產(chǎn)酒精，也可以達到降低能耗，提高酒精生產(chǎn)率的目的[13]。

目前乙醇生產(chǎn)需要對原料進行糊化處理，是一個高耗能過程。本團隊前期研究表明，利用糖木薯發(fā)酵，可以不經(jīng)過糊化，獲得較高的乙醇轉(zhuǎn)化效率。但是，原始的糖木薯由于淀粉含量過低，導(dǎo)致酒精總產(chǎn)量不高，在大規(guī)模推廣應(yīng)用之前，需要對其進行遺傳改良。這就需要在木薯品種選育時對品種進行多種品質(zhì)性狀，多種因素的綜合評定。能源木薯最終以高產(chǎn)酒精為目標，因此，研究與高產(chǎn)酒精相關(guān)的品質(zhì)性狀及其重要。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所王文泉研究組將國內(nèi)木薯品系與從巴西引進的糖型木薯品系雜交，獲得一系列木薯新品系。本研究擬通過對其中28個品系（8個糖型、20個淀粉型）的品質(zhì)性狀及發(fā)酵特性評價，研究品質(zhì)性狀與發(fā)酵特性的相互關(guān)系，為能源木薯品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

28個木薯品系（包括8個糖型、20個淀粉型）的塊根：取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所（以下簡稱“生物所”）木薯品系比較試驗地，地點為海南省澄邁縣白蓮鎮(zhèn)。SM是來自巴西的糖型木薯自然突變體；SMH是以SM為親本，與巴西本地品種雜交選育的品系。SM和SMH塊根中還原糖含量（以鮮質(zhì)量計，下同）＞2%，淀粉含量＜4%，其發(fā)現(xiàn)單位（巴西國家農(nóng)牧研究院）稱其為糖型木薯（sugary cassava）[14]。其他糖型木薯后代品系均為以SM或SMH為親本與國內(nèi)木薯品系雜交所獲得的后代。SC205木薯是湖南農(nóng)業(yè)大學、湖南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心選育的淀粉型木薯代表品系，其還原糖含量＜0.5%，淀粉含量＞15%。其余淀粉型木薯品系均為以SC205為親本與國內(nèi)其他木薯品種雜交選育的后代品系。

高溫α-淀粉酶（4萬U/g）：成都西亞化學科技有限公司；釀酒高活性干酵母：安琪酵母有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：國藥集團化學試劑有限公司；糖化酶（10萬U/g）、還原糖含量檢測試劑盒（貨號：BC0235）、總糖含量檢測試劑盒貨號（貨號：BC2710）、淀粉含量檢測試劑盒（貨號：BC0705）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec8400全自動凱氏定氮儀：丹麥FOSS分析儀器公司；DHG-9240電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；5415D離心機：德國Eppendorf公司；Epoch酶標儀：美國Biotek儀器有限公司；DK-420S三用恒溫水箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；JP05D-1300破壁料理機：浙江蘇泊爾股份有限公司；TC-15套氏恒溫器：海寧新華醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

從收獲的鮮木薯中，每個品系選取3～5條外表無破損、無病蟲害的塊根，洗凈、去皮、切成1 cm見方小塊，混勻，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 測定方法

還原糖含量采用DNS法，用檢測試劑盒（貨號：BC0235）進行測定[15]；總糖含量采用檢測試劑盒貨號（貨號：BC2710）測定[16]；淀粉含量采用檢測試劑盒（貨號：BC0705）測定[17]；干物質(zhì)量采用烘干法[18]；灰分含量采用馬弗爐灼燒法[19]；粗蛋白含量采用凱氏定氮法[20]。

酒精產(chǎn)率的測量和計算參考鐘坤等[21]的方法，根據(jù)各品系木薯干物率，將鮮木薯酒精產(chǎn)率換算為每100 g干質(zhì)量的酒精產(chǎn)率。

1.3.3 酒精發(fā)酵

從28個木薯品系中分別選取了3個糖型（SM、SM03、56-7）和5個淀粉型（SC205、ITBB01、27-4、S05、S16）品系，每次取100 g鮮木薯塊根，加10 mL蒸餾水，用勻漿機粉碎，分別進行糊化糖化、只糖化不糊化以及不做任何預(yù)處理的發(fā)酵產(chǎn)酒精實驗。

（1）糊化＋糖化

參考易戈等[22]的方法，將粉碎的木薯漿裝于三角瓶內(nèi)，按10 U/g木薯添加高溫α-淀粉酶，60 ℃水浴30 min；升溫至100 ℃糊化2 h，自然冷卻至60 ℃。調(diào)pH至4.5，按150 U/g加入糖化酶，攪拌均勻，待其冷卻至35 ℃。按10%接種量加入安琪釀酒高活性干酵母，封口后按照使用說明書，在33 ℃恒溫發(fā)酵3 d。

（2）無糊化＋糖化

將粉碎的木薯漿裝于三角瓶內(nèi)，60 ℃水浴30 min。調(diào)pH至4.5，按150 U/g加入糖化酶，攪拌均勻待其冷卻至35 ℃。按10%接種量加入安琪釀酒高活性干酵母，封口后按照使用說明書，在33 ℃恒溫發(fā)酵3 d。

（3）無糊化＋無糖化

將粉碎的木薯漿裝于三角瓶內(nèi)，按10%接種量加入安琪釀酒高活性干酵母，封口后按照使用說明書，在33 ℃恒溫發(fā)酵3 d。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS Statistics 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，差異顯著性分析采用新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯品系塊根品質(zhì)性狀分析

根據(jù)雜交組合親本來源和塊根外觀品質(zhì)，將28個木薯品系分為淀粉型和糖型兩類，其淀粉、總糖、干物質(zhì)、粗蛋白、還原糖及灰分含量測定結(jié)果見表1。

表1 28個木薯品系塊根品質(zhì)性狀比較Table 1 Comparison of quality traits of storage roots of 28 cassava varieties

2.1.1 淀粉含量

由表1可知，28個品系淀粉含量在0.70%～20.24%之間，平均含量12.26%，品系間差異巨大。淀粉型和糖型品系的平均淀粉含量分別為14.52%、6.62%。

淀粉型木薯對照品種SC205的淀粉含量為15.40%。在淀粉型雜交后代中，淀粉含量顯著高于對照的品系有08-6，47-18，50-2，48-23（P＜0.05），占淀粉型雜交后代總數(shù)的21.05%。它們的淀粉含量分別是20.24%、19.58%、17.69%、17.16%，分別比SC205高31.4%、27.1%、14.9%、11.4%。淀粉含量顯著低于SC205的品系有8個（P＜0.05），占淀粉型后代總數(shù)的42.11%。其中，淀粉含量最低的品系03-11僅含5.09%的淀粉。與SC205淀粉含量沒有顯著差異的品系有7個（P＞0.05），占淀粉型品系總數(shù)的36.84%。

糖型木薯對照品系為SM，其淀粉含量極低，僅為0.70%。糖型木薯雜交后代淀粉含量都得到顯著提升（P＜0.05），平均為6.62%。其中，49-17更是達到了19.13%，比淀粉型對照品種SC205都要高24.22%，可見雜交篩選的作用極為顯著。

2.1.2 總糖含量

由表1可知，28個木薯品系總糖含量為6.15%～40.89%，品系間差異巨大。淀粉型和糖型品系的平均總糖含量分別為27.48%、13.28%。

淀粉型對照品種SC205總糖含量為32.34%。在淀粉型雜交后代中，總糖含量顯著高于對照的品系有16-13、47-23和47-18（P＜0.05），占淀粉型木薯品系的15.8%；其總糖分別為40.89%、36.40%和35.96%。品系16-13、47-23和47-18總糖分別比對照高26.4%、12.6%和11.2%?？偺潜葘φ盏偷钠废涤?1個，占總數(shù)的57.9%。其他品系（6個，31.6%）與對照無顯著差異（P＞0.05）。

糖型木薯對照品系SM總糖含量較低，僅為8.18%。其雜交后代中，兩個品系（SM3、49-17）總糖含量顯著高于對照（P＜0.05），分別是21.13%和25.87%，比糖型木薯對照提高了2.6和3.2倍。但是，都比淀粉型對照木薯品種SC205低。其他品系（6個）除56-2外總糖含量都比糖型木薯對照高。

2.1.3 干物質(zhì)含量

由表1可知，28個木薯品系干物質(zhì)含量為8.27%～52.17%，品系間差異巨大。淀粉型和糖型品系的平均干物質(zhì)分別為41.24%、24.03%。

SC205干物質(zhì)含量為42.46%。在淀粉型雜交后代中，干物質(zhì)含量顯著高于對照的品系有08-6、19-9、48-23、47-18、50-2、ITBB01、27-4等7個品系（P＜0.05），占淀粉型木薯品系的36.8%。上述品系干物質(zhì)含量分別比對照高8.5%～22.9%。干物質(zhì)含量最高的品系為27-4，其含量為52.17%。6個品系干物質(zhì)含量比對照低，占淀粉型木薯品系的31.6%。其他6個品系干物質(zhì)含量與對照沒有顯著差異（P＞0.05）。

糖型木薯對照品系SM干物質(zhì)含量極低，僅為8.27%，是典型的“水木薯”。糖型雜交后代平均干物質(zhì)含量達到24.03%，是對照的2.9倍。其中，干物質(zhì)含量最高的是49-17，為35.45%，但與淀粉型木薯對照還有一定差距。

2.1.4 粗蛋白含量

由表1可知，各木薯品系的粗蛋白總體上偏低，含量在0.59%～3.13%之間，平均含量為1.51%。淀粉型和糖型品系的平均粗蛋白分別為1.67%、1.09%。

SC205粗蛋白含量為1.09%。在淀粉型雜交后代中，粗蛋白平均含量有所提高。粗蛋白含量顯著高于對照的品系有05-22、03-11、16-14、16-13、14-19、17-11、17-10、47-30、48-23、28-1、47-18、47-11、50-2、ITBB01、SC05 等15個品系（P＜0.05），占淀粉型木薯品系的78.9%。粗蛋白含量最高的品系為47-18，其含量為3.13%，是對照的2.9倍。其他4個品系粗蛋白含量比對照低。

糖型木薯對照品系SM粗蛋白含量較低，僅為0.79%。糖型雜交后代平均粗蛋白量達到1.09%，有所提高。其中，粗蛋白含量最高的是49-17，為1.72%。

2.1.5 還原糖含量

由表1可知，各木薯品系的還原糖含量在0.03%～2.72%之間，平均含量為1.01%。淀粉型木薯總體上還原糖含量較低，淀粉型木薯對照品種SC205還原糖含量為0.17%。通過雜交育種，各品系平均還原糖含量提高到0.61%，提高了3.6倍。在淀粉型雜交后代中，還原糖含量顯著高于對照的品系有11個品系（P＜0.05），占淀粉型木薯品系的57.9%。其中ITBB01還原糖含量達到1.35%，是對照的7.9倍。其他8個品系還原糖含量與對照無顯著差異（P＞0.05）。

糖型木薯還原糖含量高于淀粉型木薯。其對照品系SM還原糖含量最高，為2.72%，是淀粉型對照品種SC205的16倍。糖型雜交后代平均還原糖含量為2.01%，比糖型對照明顯下降（P＜0.05）。所有7個糖型木薯品系的還原糖含量都低于對照，其中，SMH和SM03降低不顯著（P＞0.05），分別是2.64%、2.54%。

2.1.6 灰分

由表1可知，淀粉型木薯的灰分普遍高于糖型木薯，其中SC16灰分最高，為0.48%，灰分較高的有淀粉型雜交后代有08-6、47-11、27-4、SC05，灰分分別為0.36%、0.37%、0.42%、0.36%，灰分最低的為糖木薯對照SM、淀粉型雜交后代03-11，兩個品系的灰分均為0.06%。

2.2 各成分間的相關(guān)性分析

鮮木薯塊根中各成分之間的相關(guān)性分析結(jié)果見表2。

表2 成分間相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between components

由表2可知，除粗蛋白與灰分之間無相關(guān)性外，其他成分之間都存在顯著相關(guān)關(guān)系。其中，淀粉、總糖、干物質(zhì)、粗蛋白等含量之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。還原糖與其他成分之間都呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01）。因此，提高木薯塊根中還原糖含量，往往會降低淀粉等其他成分的含量。

2.3 木薯品系塊根酒精發(fā)酵特性

8個代表性木薯品系的大田產(chǎn)量數(shù)據(jù)以及塊根酒精發(fā)酵的實驗結(jié)果見表3。

表3 代表型木薯品系塊根在三種預(yù)處理后酵母發(fā)酵酒精產(chǎn)率和產(chǎn)量比較Table 3 Comparison of ethanol yield and production of typical cassava storage roots after three pretreatments fermented by yeast

由表3可知，原始糖木薯突變體SM具有極高的酒精產(chǎn)率，經(jīng)過糖化和糊化處理后，酒精產(chǎn)率達到82 mL/100 g；即使不進行糊化和糖化處理，也有約25 mL/100 g的產(chǎn)酒率，這是淀粉型木薯所不具有的優(yōu)勢。淀粉型木薯不經(jīng)過糖化和糊化處理直接發(fā)酵，幾乎產(chǎn)不出酒精。這些結(jié)果說明木薯塊根中還原糖含量是與高產(chǎn)酒精相關(guān)的品質(zhì)性狀。然而，SM的淀粉含量太低，僅0.70%，導(dǎo)致干物質(zhì)含量僅8.27%。雖然其鮮薯畝產(chǎn)量有2 295 kg，干物質(zhì)產(chǎn)量才12.65 kg/hm2，遠低于其他品系。其酒精畝產(chǎn)量在塊根干粉糖化糊化處理后發(fā)酵，只有10.4 L/hm2。由于還原糖含量與干物質(zhì)含量及淀粉等性狀呈負相關(guān)，通過育種技術(shù)打破負相關(guān)是培育能源木薯新品種的必要手段。

經(jīng)過對SM進行雜交改良，糖木薯新品種SM03，淀粉含量提高到7.69%，是SM的10倍；干物質(zhì)含量提高至29.12%，是SM的3.5倍；鮮薯產(chǎn)量也顯著提高，達到222.13 kg/hm2。雖然發(fā)酵后酒精產(chǎn)率下降至53.7 mL/100 g（下降了34.5%），酒精產(chǎn)量上升至34.73L/hm2，比對照品種SC205提高了54.6%。SM03不經(jīng)過高耗能的糊化處理，只進行糖化預(yù)處理，酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精達到31.13 L/hm2，比SC205經(jīng)過糖化糊化處理后發(fā)酵的酒精產(chǎn)量（22.47 L/hm2）還高，高出38.6%。另外，新品種S16號，在只進行糖化預(yù)處理的實驗中，也達到達到較高的產(chǎn)量，產(chǎn)酒精27.80 L/hm2的水平，比SC205經(jīng)過糖化糊化處理后發(fā)酵的酒精產(chǎn)量高出23.7%。由于省略糊化步驟可以節(jié)省能源，降低加工成本，因此，SM03和S16是兩個具有極大推廣價值的能源木薯新品種。

3 結(jié)論

本研究測定了28個木薯品系塊根的干物質(zhì)、淀粉、總糖、還原糖、粗蛋白和灰分等主要品質(zhì)性狀。結(jié)果表明，糖型木薯總體上還原糖含量高、淀粉含量低；其中SM還原糖含量最高，達到2.72%。淀粉型木薯總體上具有較高的淀粉、總糖、干物質(zhì)和粗蛋白含量；其中16-13總糖含量最高，達到40.89%；08-6的淀粉含量最高，達到20.24%，比淀粉型對照SC205高31%，屬于適用于淀粉加工的木薯品系；47-18粗蛋白含量最高達到3.13%，適用于食用或飼料用途。糖型木薯酒精產(chǎn)率高，其中SM酒精產(chǎn)率達到82.29 mL/100 g。提高還原糖含量有利于木薯生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇，然而，還原糖含量與淀粉和干物質(zhì)含量呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。通過雜交育種，可以打破這種負相關(guān)，其中，品系49-17在維持了較高的還原糖含量的同時，淀粉含量提高到高于淀粉型木薯對照品種的水平；改良型糖木薯SM03，其塊根轉(zhuǎn)化乙醇的效率達到53.7 mL/100 g，雖然比糖型木薯SM轉(zhuǎn)化乙醇效率大幅降低，但產(chǎn)量是SM的6.28倍，產(chǎn)酒精34.7 L/hm2，因此，SM03可作為乙醇專用木薯新品種。另外，新品種S16在只糖化不糊化預(yù)處理的發(fā)酵實驗中，達到了產(chǎn)酒精27.8 L/hm2的水平，比SC205提高了27.1%。由于省略糊化步驟可以節(jié)省能源，降低加工成本，S16也可作為能源木薯新品種推廣應(yīng)用。