運(yùn)動對胰島素抵抗大鼠肝臟BIM信號通路的影響*

完建永， 張 勇， 劉世強(qiáng)， 華田苗， 孫慶艷

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 蕪湖 241000)

肥胖是體內(nèi)脂肪，尤其是甘油三酯積聚過多導(dǎo)致脂肪組織體積異常擴(kuò)展的病理狀態(tài)。肥胖會促進(jìn)肝內(nèi)脂肪滴的形成導(dǎo)致胰島素抵抗，而胰島素抵抗是2型糖尿病主要發(fā)病機(jī)制[1, 2]。Bcl-2細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子(Bcl-2 interacting mediator of cell death, BIM)是BCL-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白家族中僅含BH3結(jié)構(gòu)域蛋白中最重要的成員，其除參與細(xì)胞凋亡外，還參與肝細(xì)胞代謝，是調(diào)節(jié)胰島素抵抗的關(guān)鍵分子[3, 4]。已有研究表明，肝臟BIM表達(dá)的增加會增強(qiáng)c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1, JNK1)的磷酸化，從而導(dǎo)致胰島素信號通路受損，加重胰島素抵抗[5]。過去的研究發(fā)現(xiàn)長期游泳訓(xùn)練的大鼠具有顯著改善的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[6, 7]，同時(shí)其體重出現(xiàn)顯著的下降，從而提出一個(gè)問題，胰島素敏感性的改善是運(yùn)動本身的結(jié)果，還是僅僅是減肥的效應(yīng)。因此本研究通過建立肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模型，再給予慢性和急性的游泳運(yùn)動干預(yù)，檢測肝臟中BIM信號通路變化，探究運(yùn)動改善肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗的分子機(jī)制，以期為臨床和實(shí)驗(yàn)研究中采用運(yùn)動訓(xùn)練來改善胰島素抵抗及相關(guān)代謝類疾病提供更多的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級7周齡的雄性SD大鼠40只，購買于江蘇省青龍山動物繁殖場(準(zhǔn)SCXK(蘇)2012-0008)。動物自由進(jìn)食飲水，環(huán)境溫度26～28 ℃，相對濕度(55.6±4)%，明暗周期為12 h： 12 h。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)施經(jīng)安徽師范大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

垂直凝膠電泳儀(Bio-Rad)；臺式高速離心機(jī)(長沙湘儀)；血糖儀(Roche)；BCA試劑盒(碧云天)；BIM antibody、SAPK/JNK antibody、phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185) antibody、IRS1 antibody、phosphor-IRS1(Ser307) antibody、Akt antibody、phospho-Akt(Ser473) antibody均購自Cell Signaling Technology公司；GAPDH antibody(Sangon Biotech)。

1.3 肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模型建立及運(yùn)動干預(yù)

大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱量體重(220～260 g)，隨機(jī)分為4組，每組10只：對照組(control group, Con)，普通飼料(含65%碳水化合物，22%蛋白質(zhì)，13%脂肪)再喂養(yǎng)16周；高脂膳食安靜組(high-fat diet sedentary group, HFD-SED)，高脂飼料(含40%碳水化合物，22%蛋白質(zhì)，38%脂肪)再喂養(yǎng)16周。慢性運(yùn)動組(chronic exercise intervention group，HFD-CE)，高脂飼料再喂養(yǎng)16周，同時(shí)在后8周(第10周至第17周)進(jìn)行5%體重負(fù)重的游泳運(yùn)動，每日1 h，一周5 d；急性運(yùn)動組(acute exercise intervention group，HFD-AE)，高脂飼料再喂養(yǎng)16周，在第17周的最后一天進(jìn)行一次6 h的急性游泳運(yùn)動，同樣5%的體重負(fù)重，運(yùn)動過程分兩個(gè)3 h進(jìn)行，中間間隔休息45 min。

1.4 口服糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素釋放實(shí)驗(yàn)

運(yùn)動干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠空腹12 h后進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)和胰島素釋放試驗(yàn)，其中慢性運(yùn)動組大鼠在運(yùn)動后48 h(包含12 h禁食)，急性運(yùn)動組大鼠在運(yùn)動結(jié)束16 h(包含12 h禁食)時(shí)進(jìn)行。用50%葡萄糖溶液灌胃(2 g/kg)，分別在糖負(fù)荷前(0 min)和糖負(fù)荷后30、60、90、120 min時(shí)刻進(jìn)行眼眶內(nèi)眥靜脈取血0.5 ml，使用羅氏血糖儀測定即時(shí)血糖，取出的血液室溫靜置30 min，4 000 r /min離心5 min，分離血清，-80℃保存待以大鼠胰島素ELISA試劑盒(華美，武漢)測定血清胰島素含量。繪制葡萄糖曲線和胰島素曲線，計(jì)算曲線下面積，再計(jì)算胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index)=葡萄糖曲線下面積/胰島素曲線下面積[8, 9]。

1.5 樣本采集

口服糖耐量試驗(yàn)和胰島素釋放試驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)進(jìn)行麻醉后處死，取所有內(nèi)臟脂肪稱重。取肝臟，稱重后立即放入液氮罐中，于-80℃保存。

1.6 Western blot檢測肝臟中BIM蛋白水平和JNK1-IRS1-Akt總蛋白水平及磷酸化水平

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動干預(yù)對肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠體重，內(nèi)臟脂肪質(zhì)量和胰島素敏感性指數(shù)的影響

與對照組相比，16周的高脂膳食喂養(yǎng)顯著增加高脂膳食安靜組大鼠的體重和內(nèi)臟脂肪質(zhì)量(P<0.01)。與高脂膳食安靜組大鼠相比，慢性運(yùn)動組大鼠體重和內(nèi)臟脂肪質(zhì)量均顯著下降(P<0.01)。與高脂膳食安靜組大鼠相比，急性運(yùn)動組大鼠的體重和內(nèi)臟脂肪質(zhì)量無顯著變化。與對照組大鼠相比，高脂膳食安靜組大鼠胰島素敏感性指數(shù)顯著降低(P<0.01)，表明具有胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。與高脂膳食安靜組大鼠相比，慢性運(yùn)動組和急性運(yùn)動組大鼠的胰島素敏感性指數(shù)均顯著增強(qiáng)(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of exercise intervention on body weight, visceral fat weight and insulin sensitivity index in obese-induced insulin resistance rats n=10)

2.2 運(yùn)動干預(yù)對肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠肝臟中BIM蛋白水平，JNK1，IRS1和Akt磷酸化水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組大鼠相比，高脂膳食安靜組大鼠肝臟中BIM蛋白水平顯著增加(P<0.01)，JNK1和IRS1磷酸化水平顯著增高(P<0.01)，Akt磷酸化水平顯著下降(P<0.01)。與高脂膳食安靜組大鼠相比，慢性運(yùn)動組和急性運(yùn)動組大鼠肝臟中BIM蛋白水平顯著降低(P< 0.01)，JNK1和IRS1磷酸化水平顯著降低(P<0.01)，Akt磷酸化水平顯著增高(P<0.01，圖1，表2)。

Fig. 1 The results of Western blot

Tab. 2 Effects of exercise intervention on BIM protein level, JNK1, IRS1 and Akt phosphorylation in liver of obese-induced insulin resistance rats n=10)

3 討論

胰島素抵抗(insulin resistance, IR)是機(jī)體中胰島素對葡萄糖利用率下降，血糖異常升高，胰島素分泌過多的現(xiàn)象，是2型糖尿病和高胰島素血癥等代謝類疾病的致病因素[10, 11]。胰島素抵抗的發(fā)生與長期過量的高脂膳食攝入和缺乏鍛煉的生活方式有關(guān)。

Bcl-2細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子(Bcl-2 interacting mediator of cell death, BIM)是BCL-2蛋白家族的成員，在多種組織中都有表達(dá)，是肝細(xì)胞凋亡和線粒體功能的重要調(diào)節(jié)因子[12]。最近的研究表明，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，肝臟中BIM蛋白水平會異常升高，從而調(diào)控c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1, JNK1)依賴的胰島素信號通路。BIM 通過增強(qiáng)JNK1的磷酸化作用，引起胰島素受體底物(insulin receptor substance 1, IRS1)在絲氨酸307位點(diǎn)磷酸化，從而抑制Akt在絲氨酸473位點(diǎn)的磷酸化，降低肝臟的胰島素敏感性，引起機(jī)體全身性的胰島素抵抗[5]。

過去的研究表明，有規(guī)律的體育運(yùn)動可以降低炎癥狀態(tài)，增加肝臟，脂肪組織和骨骼肌等胰島素靶組織的胰島素敏感性，使機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性變化并帶來長期益處[13, 14]。而與運(yùn)動不足相關(guān)的代謝失調(diào)則會加重胰島素抵抗[15,16]。運(yùn)動作為一種有效的非藥物治療手段，已廣泛應(yīng)用于防治由胰島素抵抗引起的慢性代謝疾病，而有關(guān)運(yùn)動改善胰島素抵抗的分子機(jī)制研究依然較少，有待進(jìn)一步探究[17]。本研究參考Alexandre[18]等人的研究方法，用高脂膳食喂養(yǎng)大鼠建立胰島素抵抗大鼠模型，并進(jìn)行慢性運(yùn)動和急性運(yùn)動兩種運(yùn)動干預(yù)方式[14, 19]。干預(yù)結(jié)束后對大鼠進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)和胰島素釋放試驗(yàn)，獲得葡萄糖和胰島素曲線，從而計(jì)算胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index)。胰島素敏感性指數(shù)可描述胰島素抵抗的程度，胰島素敏感性越低，胰島素抵抗程度越高。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，高脂膳食安靜組大鼠的體重和內(nèi)臟脂肪質(zhì)量顯著增加，胰島素敏感性指數(shù)顯著降低，表明肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模型建立成功。8周的慢性游泳運(yùn)動干預(yù)顯著降低大鼠的體重和內(nèi)臟脂肪質(zhì)量，提高機(jī)體的胰島素敏感性；一次性的急性運(yùn)動對胰島素抵抗大鼠的體重和內(nèi)臟脂肪質(zhì)量無顯著影響，但機(jī)體的胰島素敏感性顯著提高。這些結(jié)果表明運(yùn)動干預(yù)改善肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，16周的高脂膳食喂養(yǎng)顯著增加高脂膳食安靜組大鼠肝臟的BIM蛋白水平，同時(shí)增強(qiáng)JNK1和IRS1的磷酸化水平，降低Akt的磷酸化水平，這與過去的機(jī)制研究結(jié)果是相一致的[5]。在此基礎(chǔ)上，我們采用兩種運(yùn)動干預(yù)方式，全面研究運(yùn)動干預(yù)對胰島素抵抗及BIM相關(guān)信號通路的影響。結(jié)果顯示，與高脂膳食安靜組大鼠相比，慢性運(yùn)動和急性運(yùn)動干預(yù)均顯著降低肝臟的BIM蛋白水平，降低JNK1和IRS1的磷酸化水平，增強(qiáng)Akt的磷酸化水平。

綜上所述， 8周的慢性游泳運(yùn)動和6 h的急性游泳運(yùn)動干預(yù)都能夠改善肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，并對胰島素抵抗大鼠肝臟中的BIM-JNK1-IRS1-Akt信號通路產(chǎn)生明顯的調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果為運(yùn)動干預(yù)改善胰島素抵抗的分子機(jī)制提供新的研究進(jìn)展。綜合已有的研究結(jié)果，表明急性運(yùn)動的干預(yù)作用維持時(shí)間相比慢性運(yùn)動較短，且急性運(yùn)動對體重?zé)o明顯降低作用。因此，臨床上建議采用長期的、規(guī)律的慢性有氧運(yùn)動對胰島素抵抗及相關(guān)代謝類疾病進(jìn)行干預(yù)治療。