細胞周期蛋白依賴性激酶在miR-193a5p調(diào)控卵巢癌細胞增殖及上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)變中的作用*

楊尊敬， 杜先玲

(恩施州中心醫(yī)院腫瘤科， 湖北 恩施 445000)

全世界每年約有220,000名女性患卵巢癌，是發(fā)達國家婦科惡性腫瘤相關(guān)癌癥死亡的第四大原因[1]。卵巢癌可分為六個亞組，即漿液性，粘液性，子宮內(nèi)膜樣，移行細胞癌，透明細胞癌和鱗狀細胞癌[2]。Feng Y等人[3]通過微陣列數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p為改善卵巢癌的化療敏感性的潛在靶標。Ren X等人[4]發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p可提高卵巢癌的診斷能力，可以作為候選生物標志物。細胞周期蛋白依賴性激酶14(Cyclin-Dependent Kinase 14, CDK14)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞周期進程和細胞增殖的調(diào)節(jié)[5]。Zhang W等人[6]發(fā)現(xiàn)CDK14的表達與多種臨床病理因素相關(guān)，包括腫瘤分級，F(xiàn)IGO分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ki-67表達，并影響卵巢癌細胞增殖，遷移和侵襲。CDK14也可調(diào)控癌癥細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial‐mesenchymal transition, EMT)[7]。然而，miR-193a-5p與CDK14在卵巢癌細胞OVAC中的關(guān)系仍未報道。基于此，本研究旨在探討miR-193a-5p與CDK14在卵巢癌細胞OVAC增殖和EMT之間的關(guān)系，為使用miRNA治療卵巢癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

miR-193a-5p序列來自miRBase(http://www.mirbase.org/)，miR-193a-5p mimics和miR-193a-5p inhibitor由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。miR-193a-5p SYBR Green miRNA熒光定量PCR試劑盒購自HaiGene公司(貨號：AP02314、批號：CUDIV6B2)。miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購自上海滬震實業(yè)有限公司(貨號：HZ130911-25、批號：IU13I1)。CDK14, E-cadherin，vimentin、fibronectin、TUBULIN抗體購自abcam公司(貨號：ab175489、批號：46731034134；ab1416、批號：06137773828；ab8978、批號：97772918624；ab32419、批號：97299240093；ab32124、批號：13573127795)。OVAC細胞購自廈門慧嘉生物科技有限公司(貨號：X1278、批號：GB1BK1)。RPMI-1640培養(yǎng)基購自武漢純度生物科技有限公司(貨號：CD-100043GM、批號：O58963)，優(yōu)級胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司(貨號：11011-8611、批號：F40I58SOSD26EYZ)。蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA, mini片劑) 購自bimake公司(貨號：B14011、批號：K6LJZ3NF)。PBS購自天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司(貨號：MA0015、批號：3FBJ9FYKVDD3LA5)。青鏈霉素混合液(100×)購自上海億言生物科技有限公司(貨號：SL6040-100 ml、批號：CQ83GF1KGP16)。2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購自上海樊克生物科技有限公司(貨號：FK-ZH536J、批號：9HHKR0Q3)?？焖俚鞍琢呀庖嘿徸陨虾Ｐ旁Ｉ锟萍加邢薰?貨號：XY-3221-1、批號：H867MTG8R17C0-P)。cyclofect轉(zhuǎn)染試劑購自大連興典生物科技有限公司(貨號：cyclofectalpha001a、批號：KT1YPT3Q)。P3mirGLO質(zhì)粒購自優(yōu)寶生物公司(貨號：VT1439、批號：NT98-WBKH8WPK-2)。Luciferase熒光素酶報告檢測試劑盒購自齊一生物科技(上海)有限公司(貨號：K801-200、批號：63698282970)。MTT試劑盒購自上海浩然生物技術(shù)有限公司(貨號：M2128、批號：1W3BQQS8HBV)。CCK-8試劑盒購自南京恩晶生物科技有限公司(貨號：E1CK-00208、批號：406MIKO2)。

1.2 熒光素酶報告試驗檢測miR-193a-5p靶向CDK14

將CDK14的3‘UTR克隆進P3mirGLO質(zhì)粒，同時克隆CDK14的3‘UTR的UG突變進P3mirGLO質(zhì)粒。將每孔總共5×104個OVAC細胞接種在24孔板中。培養(yǎng)24 h后，用含有200 ng/ml雙熒光素酶報告質(zhì)粒和40 nmol/L miR-193a-5p mimics混合后轉(zhuǎn)染細胞。使用熒光素酶報告檢測試劑盒在轉(zhuǎn)染后24 h通過酶標儀測量熒光素酶活性。所有轉(zhuǎn)染獨立重復(fù)至少三次。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

卵巢癌細胞OVAC在37℃ 5% CO2含有100 U/ml青霉素-100 μg/ml鏈霉素和10%熱滅活的FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中孵育。通過cyclofect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞OVAC。將miR-193a-5p mimics或miR-193a-5p inhibitor與cyclofect脂質(zhì)體混合，靜止大約20 min后，緩緩滴入OVAC細胞，轉(zhuǎn)染后24 h進行下游實驗。

1.4 實時熒光定量PCR檢測miR-193a-5p的相對表達量

將卵巢癌細胞OVAC用細胞刮刮下，裝入 1.5 ml的EP管中，用PBS洗3次。使用miRNA快速提取試劑盒抽取OVAC的miRNA。使用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將純化好的總miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄。用miR-193a-5p SYBR Green miRNA熒光定量PCR試劑盒在ABI7500儀器上進行qPCR反應(yīng)，實驗重復(fù)三次。使用2-ΔΔct值表示結(jié)果。

1.5 免疫印跡檢測CDK14、E-cadherin、vimentin、fibronectin、TUBULIN的表達

進行10%SDS-PAGE的電泳[8]，然后轉(zhuǎn)移到Immobilon-P PVDF膜(0.45 μm孔徑)。將PVDF膜在室溫下在含有0.01%Tween-20和5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5,150 mmol/L NaCl)中封閉1 h，然后在4℃下與目的蛋白的抗體(CDK14：1∶1 000, E-cadherin：1∶3 000，vimentin：1∶3 000、fibronectin：1∶3 000、TUBULIN：1∶8 000)溫育過夜后將膜在室溫下與綴合有HRP的相應(yīng)二抗孵育1 h。用ECL Plus Western印跡檢測系統(tǒng)觀察特定蛋白質(zhì)[9]。

1.6 MTT試驗檢測UVAC細胞活力

第1日用卵巢癌細胞OVAC細胞，將OVAC細胞稀釋至7.5×104cells/ml。向96孔板的每個孔中加入100 μl細胞并孵育過夜。第2日進行過表達miR-193a-5p或者基因沉默miR-193a-5p處理細胞。第3日，向每個孔中加入20 μl 5 mg/ml MTT。在培養(yǎng)箱中37℃孵育3.5 h。用錫箔覆蓋并在軌道振蕩器上攪拌細胞15 min。讀取590 nm處的吸光度。

1.7 CCK-8實驗檢測UVAC細胞增殖

在96孔板中分配100 μl OVAC細胞懸浮液(5×103cells/ml)。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)孵育24 h(37℃，5% CO2條件下)。將10 μl不同濃度的待測物質(zhì)加入板中。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適當?shù)臅r間(0 d、1 d、2 d、3 d、4 d)。再向每個孔中加入10 μl CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育4 h。使用酶標儀測量450 nm處的吸光度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-193a-5p mimic后對CDK14 3’UTR的熒光素酶相對活性的影響

通過Targetscan在線工具分析，發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p與CDK14的3‘UTR高度匹配，且匹配區(qū)域位于3‘UTR的160-166位置。將匹配區(qū)域做UG突變，發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p靶向CDK14的3‘UTR(P<0.05，圖1，表1)

Tab. 1 miR-193a-5p targets CDK14

2.2 過表達miR-193a-5p后對卵巢癌細胞OVAC的增殖、細胞活力和EMT的影響

轉(zhuǎn)染miR-193a-5p mimics后，通過q-PCR檢測到miR-193a-5p的表達量增高(P<0.05, 1.03±0.11vs1.78±0.05)。裂解細胞后，通過WB檢測到CDK14的表達量下降(P<0.05)，EMT相關(guān)蛋白質(zhì)E-cadherin的表達量上升(P<0.05)，vimentin、fibronectin和N-cadherin的表達量下降(P<0.05，圖2)。并且，過表達miR-193a-5p后，卵巢癌細胞OVAC的增殖和細胞活力均增加(P<0.05，表2，表3)。

Fig. 2 Overexpression of miR-193a-5p, WB detects CDK14 and EMT-related protein expression

Tab. 2 CCK-8 detects cell proliferation after overexpression of miR-193a-5p

Tab. 3 The activity of MTT cells after overexpression of miR-193a-5p

2.3 基因沉默miR-193a-5p后對卵巢癌細胞OVAC的增殖、細胞活力和EMT的影響

轉(zhuǎn)染miR-193a-5p inhibitor后，通過q-PCR檢測到miR-193a-5p的表達量下降(P<0.05, 1.04±0.12vs0.32±0.05)。裂解細胞后，通過WB檢測到CDK14的表達量上升(P<0.05)，EMT相關(guān)蛋白質(zhì)E-cadherin的表達量下降(P<0.05)，vimentin、fibronectin和N-cadherin的表達量上升(P<0.05，圖3)。并且，基因沉默miR-193a-5p后，卵巢癌細胞OVAC的增殖和細胞活力均下降(P<0.05，表4，表5)。

3 討論

卵巢癌是女性因癌癥而死亡的第四大原因，其整體5年生存率約為30%[10]。由于卵巢癌的早期臨床癥狀不典型，大約70%的患者在診斷時腫瘤已經(jīng)超出卵巢傳播到盆腔和腹腔器官。盡管近年來已經(jīng)應(yīng)用了外科手術(shù)和細胞毒性治療，但卵巢癌的5年生存率仍只有30%。這主要是因為對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制了解不夠深入。因此，進一步研究促進卵巢癌進展的分子機制對于尋找新的治療方法和改善這種疾病的預(yù)后將是有意義的。

Fig. 3 Detection of CDK14 and EMT-related protein expression by WB after knockdown of miR-193a-5p

Tab. 4 CCK-8 detects cell proliferation after knockdown of miR-193a-5p

Tab. 5 MTT assay for cell viability after knockdown of miR-193a-5p

miRNA是一種微小的非蛋白質(zhì)編碼RNA，通過與靶mRNA中部分互補的靶位點相互作用，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達。越來越多的研究者在卵巢癌中進行了miRNA表達譜分析[11]。 例如， miR-106b，miR-143，miR-145，miR-125b等具有致癌功能的miRNA; miR-30，miR-124和miR-199等具有腫瘤抑制作用的miRNA[12-15]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p靶向CDK14的3‘UTR的160-166位置。過表達miR-193a-5p后， CDK14的表達量下降；但基因沉默miR-193a-5p后， CDK14的表達量上升。CDK14已被證明在控制細胞周期進程和細胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。提示miR-193a-5p可能調(diào)控卵巢癌的細胞周期進程和細胞增殖。

最近，有證據(jù)表明CDK14在幾種惡性腫瘤中表達增加，例如食道癌，肝細胞癌，乳腺癌，并參與細胞周期，腫瘤增殖，侵襲，遷移的調(diào)節(jié)，這進一步影響了腫瘤的預(yù)后[17]。在本研究中，miR-193a-5p引起的CDK14表達降低，導(dǎo)致CDK14的表達量下降，卵巢癌細胞OVAC的增殖、細胞活力和EMT的上升；同時，基因沉默miR-193a-5p導(dǎo)致CDK14表達量的上升，造成卵巢癌細胞OVAC的增殖、細胞活力和EMT的下降。CDK14參與控制真核細胞周期，其活性由相關(guān)的細胞周期蛋白控制。CDK14通過與CCDN3的相互作用，作為細胞周期進展和細胞增殖的促進因子。因此，miR-193a-5p通過靶向CDK14的3‘UTR以減少CDK14在mRNA水平上降低，進而導(dǎo)致CDK14在蛋白水平上下降，與CCDN3相互作用的CDK14蛋白減少，CCDN3促進增殖和細胞活力的能力降低，最終導(dǎo)致卵巢癌細胞OVAC的增殖、細胞活力和EMT的減少?；虺聊珻DK14后能夠抑制胰腺癌細胞的增殖，侵襲和遷移并抑制EMT的進展[18]。提示miR-193a-5p可能是在多種癌癥中被抑制，如果通過體外合成miR-193a-5p的注射至患者的癌組織或癌組織被切除的部位可能會抑制癌癥的復(fù)發(fā)。但是，miR-193a-5p具體的劑量和給予方式需要進一步探索。盡管卵巢癌有6種類型，但是本研究僅在細胞水平探討miR-193a-5p的作用機制，具體miR-193a-5p靶向CDK14的3‘UTR可應(yīng)用于哪一種癌癥仍然需要進一步的探索。在上皮性卵巢癌中， CDK14在上皮性卵巢癌細胞系和上皮性卵巢癌組織中均過表達，CDK14表達水平與腫瘤分級，淋巴轉(zhuǎn)移以及預(yù)后不良有關(guān)[19]。本研究創(chuàng)新性地報道了卵巢癌中基于 miR-193a-5p 的CDK14高表達的潛在機制，miR-193a-5p成為潛在的靶向治療卵巢癌的miRNA。在體外合成miR-193a-5p后，可通過藕連某個特異性識別卵巢癌的分子靶向進入卵巢癌細胞內(nèi)，通過降解CDK14的mRNA來達到抑制或治療卵巢癌的目的。因此，本研究豐富了miRNA在卵巢癌發(fā)生發(fā)展的潛在功能，并為小分子RNA治療卵巢癌提供了理論基礎(chǔ)。