miRNA-95靶向FOXD1基因?qū)Y(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制*

梁宛伶， 肖天?！?， 袁 峰， 曹一波， 顏登國

(1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸外科， 貴陽 550001； 2. 四川省自貢市第一人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科， 自貢 643000； 3. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸外科， 貴陽 550001)

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一,手術(shù)切除是結(jié)直腸癌的主要治療方式。為控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,提高結(jié)直腸癌患者的5年生存率，放化療成為常見的輔助治療手段[1]。放射治療過程中,影響治療效果的主要原因就是放射敏感性降低,而微小RNA(microRNA,miRNA)對癌癥的診斷和治療存在著巨大的潛在價值,近年來, miRNA 逐漸成為一種新型的非侵入性的疾病早期診斷的標(biāo)志物[2-3]。腫瘤形成中miRNA-95發(fā)揮著不同的功能,miRNA-95在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈現(xiàn)上升趨勢,抑制細(xì)胞凋亡,影響腫瘤的放療敏感性,但在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中卻呈現(xiàn)低表達(dá)[4]。miRNA-95與腫瘤抗輻射性密切相關(guān),在某些抗輻射的腫瘤細(xì)胞中,miRNA-95會出現(xiàn)過表達(dá),過表達(dá)miRNA-95會使肺癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并對輻射治療產(chǎn)生抗性[5]。提示miRNA-95可能成為腫瘤細(xì)胞放射敏感性的參考指標(biāo),亦可能是腫瘤治療的有效新靶點。

叉頭框(forkheadbox,FOX)家族的成員FOXD1位于5q12染色體上,具有調(diào)控細(xì)胞周期。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)和抑制轉(zhuǎn)錄的作用[6]。目前發(fā)現(xiàn),FOXD1基因存在于真核生物組織和細(xì)胞中,在肺癌和結(jié)直腸癌中FOXD1表達(dá)異常,FOXD1過表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān),且促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,是潛在的致癌基因[7]。但在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,FOXD1表達(dá)升高后細(xì)胞的增殖能力和轉(zhuǎn)移能力明顯升高,但與臨床預(yù)后無關(guān)。由此本文通過建立轉(zhuǎn)染細(xì)胞分組進(jìn)行X射線照射實驗,探討miRNA-95靶向FOXD1基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞放射敏感性的有機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)的miR-133b模擬物(miRNA-95-mimics)。抑制物(miRNA-95-inhibitions),上海博升生物科技有限公司生產(chǎn)的RPMI-1640培養(yǎng)基,上海撫生實業(yè)有限公司生產(chǎn)的CCK-8檢測試劑盒。BCA蛋白濃度測定試劑盒,北京中科科爾儀器有限公司生產(chǎn)的Real-time PCR儀，30只BALB/C-nu雄性裸鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,8周齡,體質(zhì)量(20 g±2 g)，結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 裸鼠成瘤實驗

相同轉(zhuǎn)染而未經(jīng)X射線照射的C組、M組、I組LoVo細(xì)胞,制成細(xì)胞濃度為5×107cells/ml的細(xì)胞懸液，各取0.2 ml分別接種于C組、M組、I組BALB/C-nu雄性裸鼠左下肢足部皮上1次,每組10只，注射2周后，待腫瘤生長至100 mm3時，各組選取5只裸鼠進(jìn)行X射線照射,每天4 Gy 照射一次,連續(xù)照射15 d，其余小鼠不照射,15 d后處死裸鼠并取出腫瘤進(jìn)行稱重。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

在RPMI-1640培養(yǎng)基加入含10%胎牛血清,再加入1%氰基鏈霉素,將LoVo細(xì)胞放入培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),培養(yǎng)條件:溫度37℃,CO2濃度5%,待細(xì)胞生長至80%～90%時,離心傳代，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 細(xì)胞分組與實驗設(shè)計

傳代培養(yǎng)時,每2周用濃度為2 mg/ml的DDP進(jìn)行沖洗,然后加入2 ml濃度1×105cells/well對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞生長至60%～70%時,按照說明書取50 pmol miRNA-95-mimics、miRNA-95-inhibitions加入無血清稀釋液，制成25 μl的RNA稀釋液與Lipofectamine2000混合，然后將含有miRNA-95-mimics、miRNA-95-inhibitions以Lipofectamine2000為載體分別在LoVo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-95-mimics。miRNA-95-inhibitions,并分組:C組(對照組正常LoVo細(xì)胞),M組(miRNA-95-mimics轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞),I組(miRNA-95-inhibitions轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞)，48 h后轉(zhuǎn)染成功,胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞懸液,于24孔板中接種細(xì)胞懸液,室溫放置培養(yǎng)24 h,利用直線加速器6 MV/8 Gy的X射線垂直照射細(xì)胞,劑量率3 Gy/min,照射12 h后收集細(xì)胞。采用RT-PCR法檢測LoVo細(xì)胞中FOXD1的表達(dá)情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測LoVo細(xì)胞凋亡情況,Western blot檢測細(xì)胞中FOXD1蛋白的水平,細(xì)胞克隆測定細(xì)胞存活率,裸鼠成瘤實驗檢測X射線照射后的裸鼠腫瘤體積。

1.5 細(xì)胞克隆測定LoVo細(xì)胞存活率

將8 GyX射線照射后的細(xì)胞種植到含 10 ml 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,37℃環(huán)境下培養(yǎng),孵育 14 d 細(xì)胞克隆成功,用 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,加入結(jié)晶紫染色液,染色時長 20 min,計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù),對各組細(xì)胞存活率進(jìn)行計算?？寺⌒纬陕?%) = (形成的細(xì)胞克隆數(shù)/ 接種細(xì)胞數(shù))× 100%。

1.6 RT-PCR法檢測照射后LoVo細(xì)胞中FOXD1的表達(dá)

裂解LoVo細(xì)胞提取RNA,根據(jù)FOXD1和β-actin基因序列號進(jìn)行引物。FOXD1產(chǎn)物片287 bp。β-actin產(chǎn)物262 bp,RT-PCR反應(yīng)體系為10 μl的滅菌ddH2O,上游引物 0.5 μl。下游引物與其相同。通過Trizol提取RNA定量,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR反應(yīng)條件:97℃6 min,98℃28 s,75℃30 s,80℃4 min,總計55個循環(huán)。實驗重復(fù)3次,用β-actin作參考將PCR產(chǎn)物電泳,用相對定量2-ΔΔCT計算FOXD1水平,引物序列如表1。

Tab. 1 Primer Sequences of PCR

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測照射后LoVo細(xì)胞凋亡情況

三組LoVo細(xì)胞以2×110cells/ml濃度置于6孔板,培養(yǎng)24 h,用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,用冷的70%的乙醇固定,4℃放置一天,后離心5 min倒掉上清液,用PBS洗滌5 min,重復(fù)三次。在37℃。無光照下染色30 min,用流式細(xì)胞儀分析三組細(xì)胞凋亡程度。

1.8 Western blot檢測細(xì)胞中FOXD1蛋白的水平

取三組LoVo細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,提取總蛋白測定濃度,在100 V SDS-PAGE對總蛋白進(jìn)行電泳,蛋白樣品采用Bradford法定量,將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,用10%的山羊血清,封閉0.5 h,分別加入一抗4°C孵育過夜,二抗常溫孵育1 h,常溫環(huán)境下洗膜三次,β-Actin 作內(nèi)參,用Quantity one 4.0軟件分析FOXD1蛋白表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組LoVo細(xì)胞中FOXD1的表達(dá)情況

RT-PCR法用于檢測C組、M組、I組LoVo細(xì)胞中FOXD1的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C組細(xì)胞中FOXD1表達(dá)為(3.62±1.02),M組細(xì)胞中FOXD1表達(dá)為(5.21±1.67),I組細(xì)胞中FOXD1表達(dá)為(2.34±0.95),下調(diào)I組LoVo細(xì)胞中miRNA-95表達(dá)后,FOXD1表達(dá)明顯降低,M組LoVo細(xì)胞中miRNA-95表達(dá)增加,FOXD1表達(dá)也明顯升高(P<0.05，圖1，表2)。

Fig. 1 Expression of FOXD1 in loVo cells of each group

2.2 各組LoVo細(xì)胞凋亡變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,在同樣8 Gy 照射后,I組細(xì)胞凋亡率高于C組,而M組細(xì)胞凋亡率顯著下降, C組LoVo細(xì)胞凋亡率(25.03±3.29),M組(16.23±2.96),I組(40.01± 4.32)(P<0.05，圖2，表2)。

Fig. 2 Apoptosis of Lovo cells in each group

Tab. 2 Comparison of FOXD1 expression in loVo cells of different n=3)

2.3 各組LoVo細(xì)胞中FOXD1蛋白表達(dá)

Western blot檢測FOXD1蛋白表達(dá),轉(zhuǎn)染miRNA-95-mimics模擬物后M組FOXD1蛋白(5.35±1.74)表達(dá)上升,轉(zhuǎn)染miRNA-95-inhibitions抑制物I組FOXD1蛋白表達(dá) (2.45±1.12)降低,M組FOXD1蛋白顯著高于C組(3.75± 1.23)(P<0.05),I組FOXD1蛋白顯著低于C組(P<0.05，圖3)。

Fig. 3 Effect of FOXD1 expression on loVo cells in each group

2.4 細(xì)胞克隆測定各組LoVo細(xì)胞的存活率

細(xì)胞克隆實驗檢測發(fā)現(xiàn)在8 Gy照射后,C組、M組及I組LoVo細(xì)胞的存活率分別為(42.36±2.52)%、(50.51± 3.03)%、(30.23±2.03)%，與I組比對，M組和C組LoVo細(xì)胞的單克隆存活率有上升趨勢(P<0.05，圖4)。

2.5 X射線照射對裸鼠結(jié)直腸癌移植瘤的影響

無照射結(jié)果：與M組相比,C組和I組腫瘤體積減少(P均<0.05，表3)，與C組比較，I組腫瘤體積減少(P<0.05)。X射線照射結(jié)果:照射15 d后I組裸鼠腫瘤體積顯著減小,與M組相比,C組和I組腫瘤體積減少(P均<0.05),三組裸鼠中I組腫瘤體積最小,M組腫瘤體積最大,C組次之,無照射裸鼠腫瘤體積顯著大于X射線照射組(P<0.05)，表明X射線照射可抑制細(xì)胞生長，miRNA-95低表達(dá),結(jié)直腸癌種植瘤放射敏感性提高,腫瘤的生長得到明顯抑制。

Tab. 3 Tumor volume comparison of colorectal cancer in nude n=5)

3 討論

近十年來,結(jié)直腸癌嚴(yán)重威脅著人類的身體健康,我國結(jié)直腸癌發(fā)病率約占全球的24%,死亡率約占22%[8]。目前,臨床治療手段有限,放化療效和手術(shù)預(yù)后較差,如果通過合理的綜合治療,腸癌的五年生存期可達(dá)到80%以上。大量文獻(xiàn)報道,FOXD1在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用,參與癌細(xì)胞的增殖和分化[9]。有研究證實,miRNA-95過表達(dá)會使乳腺癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞增殖并對輻射治療產(chǎn)生抗性,提示miRNA-95可能成為腫瘤細(xì)胞放射敏感性的參考指標(biāo)[10]。我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測miRNA-95的表達(dá)對LoVo細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)同樣在8 Gy照射后,miRNA-95抑制物組細(xì)胞凋亡率高于對照組,而miRNA-95模擬物組細(xì)胞凋亡率顯著下降,證實miRNA-95表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。2009年Arndt等[11]發(fā)現(xiàn)在早期(Ⅰ期。Ⅱ期)結(jié)直腸癌組織中的miRNA-95表達(dá)呈上升趨勢且高于正常組織。更進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌發(fā)生中的miRNA-95的作用,2011年Huang等[12]發(fā)現(xiàn)有機(jī)體內(nèi)和體外miRNA-95都出現(xiàn)過表達(dá),對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用,使患者放療敏感性大大降低。

近年來的研宄提示FOXD1也參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程,本研究利用Western blot和RT-PCR法檢測不同表達(dá)水平的miRNA-95對FOXD1表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)LoVo細(xì)胞中miRNA-95表達(dá)后,FOXD1表達(dá)明顯降低,上調(diào)LoVo細(xì)胞中miRNA-95表達(dá),FOXD1表達(dá)也明顯升高,轉(zhuǎn)染miRNA-95模擬物后FOXD1蛋白表達(dá)上升,miRNA-95抑制物則降低FOXD1蛋白的表達(dá),提示了解結(jié)直腸癌患者miRNA-95表達(dá)水平可以預(yù)測其接受放療效果。有研究發(fā)現(xiàn)在miRNA-95在胰腺癌組織及子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)異常，下調(diào)miRNA-95表達(dá)能有效抑制胰腺癌及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲、遷移，其表達(dá)與癌癥的發(fā)生、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[13]。FOXD1 基因存在于真核生物組織和細(xì)胞中，F(xiàn)OXD1激活主要受到多種因素調(diào)節(jié),其中主要的激活方式是被磷酸化,磷酸化FOXD1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿中發(fā)揮作用,在各種細(xì)胞、組織、器官中表現(xiàn)活躍，F(xiàn)OXD1活性的變化會影響細(xì)胞的穩(wěn)定性,當(dāng)FOXD1活化可以穩(wěn)定細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。研究發(fā)現(xiàn)FOXD1是直腸癌潛在的致癌基因,在直腸癌組織呈上升趨勢,敲低 FOXD1 的表達(dá)可抑制直腸癌細(xì)胞的增殖活性[15]。大量文獻(xiàn)報道,結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞的凋亡會受到FOXD1過表達(dá)的影響,還會對化療藥物的產(chǎn)生耐藥性。靶向基因調(diào)控FOXD1的表達(dá)影響放射的敏感性,監(jiān)測FOXD1表達(dá)是分子作用機(jī)制和生物學(xué)功能的重點[16-17]。

8 Gy照射后，miRNA-95抑制物組單克隆群數(shù)最少，腫瘤體積最小，顯著低于對照組和miRNA-95模擬物組。miRNA-95模擬物組單克隆群數(shù)及腫瘤體積均高于對照組。抑制miRNA-95的表達(dá)后FOXD1降低,提高了LoVo細(xì)胞的放射敏感性,LoVo細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長受到抑制,提高患者腫瘤放療效果，miRNA與腫瘤放療敏感性相關(guān)，miRNA-95能夠影響多種癌癥放射抵抗性，并在癌細(xì)胞系中高表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-95在放療敏感的宮頸癌腫瘤組織和輻照敏感的宮頸癌細(xì)胞中均呈低表達(dá)，而抑制miRNA-95 表達(dá)水平能夠顯著提高宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性[18]。相關(guān)研究證實，結(jié)直腸癌細(xì)胞中FOXD1表達(dá)會隨著放射劑量的升高而增長，具有一定依賴性，當(dāng)FOXD1降低后，直腸癌細(xì)胞的放射敏感性隨之提高，癌細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡[19]，F(xiàn)OXD1基因與直腸癌放療敏感或抵抗密切相關(guān)，F(xiàn)OXD1基因高表達(dá)與放療抵抗有關(guān)，降低FOXD1基因表達(dá)，放射可抑制癌細(xì)胞發(fā)展[20]。

綜上所述,miRNA-95低表達(dá)可抑制FOXD1蛋白的活性，提高LoVo細(xì)胞的放射敏感性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,提高腫瘤放療效果。