消痰化瘀利竅方對(duì)慢性間歇性低氧小鼠認(rèn)知障礙的改善作用*

趙 洋， 楊勝昌， 于富洋， 李文雅， 吉恩生

(河北中醫(yī)學(xué)院生理教研室， 石家莊 050200)

阻塞性呼吸睡眠暫停(obstructive sleep apnea，OSA)是一個(gè)由睡眠期間上呼吸道反復(fù)塌陷導(dǎo)致的睡眠障礙疾病，表現(xiàn)為打鼾、睡眠片段化、日間乏力、嗜睡等[1]。流行病學(xué)報(bào)道稱15%～24%的成年人存在不同程度的OSA，在一項(xiàng)5年的隨訪中，OSA患者罹患癡呆的風(fēng)險(xiǎn)是非OSA患者的1.7倍[2,3]。臨床研究還發(fā)現(xiàn)OSA患者存在明顯的注意力下降以及學(xué)習(xí)和記憶能力損傷，嚴(yán)重影響日常的學(xué)習(xí)和工作[4]。我們先前的動(dòng)物模型結(jié)果也表現(xiàn)出顯著的行為學(xué)成績(jī)下降[5]。慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)是OSA最主要的病理特征，有研究表明長(zhǎng)期的低氧/復(fù)氧可能是導(dǎo)致認(rèn)知障礙的主要原因[6]。海馬功能和結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)于學(xué)習(xí)和記憶具有至關(guān)重要的作用[7]。CIH暴露可破壞海馬神經(jīng)元和突觸結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致突觸后致密物質(zhì)受損和突觸素丟失，影響神經(jīng)元之間的信息傳遞，損害學(xué)習(xí)和記憶功能[8,9]。

臨床上針對(duì)OSA的治療方法主要有持續(xù)正壓通氣，口腔矯正以及手術(shù)治療等，但依然存在治療反復(fù)、患者依從性差等問題。相比之下，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)具有簡(jiǎn)便效廉的特點(diǎn)。據(jù)我們先前的研究結(jié)果表明，消痰化瘀利竅方對(duì)CIH誘導(dǎo)的大鼠心功能不全具有良好的改善作用[10]。本研究通過建立CIH小鼠模型，明確消痰化瘀利竅方對(duì)CIH誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知障礙的改善作用，探討復(fù)方對(duì)CIH暴露小鼠海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)損傷以及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的作用機(jī)制。本研究以O(shè)SA患者“痰、虛、瘀”中醫(yī)辨證為基礎(chǔ)，以期尋求改善慢性間歇性低氧誘發(fā)認(rèn)知障礙的新措施。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性C57小鼠48只，體重20～25 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。隨機(jī)平均分成四組(n=12)：常氧對(duì)照組(Normoxia)，慢性間歇性低氧組(CIH)、慢性間歇性低氧中藥干預(yù)組(Formula+CIH)、中藥對(duì)照組(Formula)。將CIH及Formula+CIH組暴露于動(dòng)物慢性間歇性低氧裝置，前1.5 min向艙內(nèi)充入100%氮?dú)馐筄2濃度降至9%，后1.5 min充入醫(yī)用氧(>99.5%)使O2濃度升至21%，每一循環(huán)3 min，每天8: 00 am-4: 00 pm上艙8 h，共35 d。Normoxia及Formula組大鼠置于低氧艙內(nèi)，但向艙內(nèi)充入空氣。同時(shí)，F(xiàn)ormula+CIH與Formula組于每天8: 00前灌胃前Formula+CIH與Formula組給予消痰化瘀利竅方灌胃(生藥量26.8 g/kg以中藥藥理研究方法學(xué)的小鼠與人藥物劑量折算方法折算臨床劑量)，CIH與Normoxia組灌服同體積生理鹽水。各組小鼠于造模26～35 d進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，35 d造模結(jié)束后應(yīng)用Y-迷宮進(jìn)行行為學(xué)測(cè)定，然后斷頭分離海馬組織，部分用多聚甲醛固定，用于尼氏染色和透射電鏡觀察結(jié)構(gòu)變化，另一部分凍存于-80℃冰箱用于Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.2 主要試劑與儀器

消痰化瘀利竅方由丹參30 g，法半夏12 g，陳皮10 g，茯苓15 g，生黃芪15 g，炒白術(shù)12 g，石菖蒲12 g，郁金12 g，射干12 g，白芥子10 g，桔梗12 g，枳殼15 g，川芎12 g，赤芍15 g，地龍12 g組成，以水煮醇沉法制備,含生藥1.1 g/ml，中藥材購自于神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司；尼氏染色液和電鏡專用2.5%戊二醛固定液(武漢塞維爾生物科技有限公司)；synapsin(proteintech，17785-1-AP)和PSD-95抗體(Servicebio，GB11277)；β-Tubulin(Servicebio，GB13017-2)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(Servicebio，GB23303)和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(Servicebio，GB23301)；BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì)，CW0014S)。動(dòng)物間歇性低氧裝置(Oxycycler Model A84, BioSpherix)。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

于造模26～35 d進(jìn)行連續(xù)10 d的水迷宮行為學(xué)檢測(cè)，包括定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。第1～5日進(jìn)行隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)(hidden platform training)，每只小鼠大鼠每天訓(xùn)練4次，分別從4個(gè)不同入水點(diǎn)面壁入水，記錄分析小鼠在訓(xùn)練期間找到平臺(tái)的時(shí)間( 潛伏期)；第6日撤去平臺(tái)進(jìn)行第1次空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠60 s 內(nèi)于原平臺(tái)所在象限的探索時(shí)間百分比。第7～9日進(jìn)行反轉(zhuǎn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)(reversal platform training)，第10日撤去平臺(tái)進(jìn)行第2次空間探索實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，進(jìn)行可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，以排除小鼠的游泳能力和視力對(duì)行為學(xué)的影響。

1.4 Y-迷宮實(shí)驗(yàn)

造模結(jié)束后，進(jìn)行Y-迷宮行為學(xué)測(cè)定。Y-迷宮由一個(gè)中心區(qū)域和周圍連接的三條完全相同的封閉臂組成，三臂互為120°角，呈三等分輻射狀。將三臂分別命名為A，B和C，將每只小鼠放于中心區(qū)域，允許小鼠自由探索5 min。計(jì)錄5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入三條臂的總次數(shù)以及正確次數(shù)(連續(xù)三次進(jìn)入無重復(fù)臂)，以正確次數(shù)評(píng)價(jià)動(dòng)物的Y-迷宮成績(jī)。

1.5 組織病理學(xué)觀察

造模結(jié)束后，取出大腦并用4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行尼氏染色。分離海馬組織置于2.5%戊二醛溶液中，包埋、切片，于電鏡下觀察突觸后致密物質(zhì)的厚度。

1.6 Western blot檢測(cè)synapsin和PSD-95的表達(dá)

分離海馬組織，按100 mg/ml加入蛋白裂解液，超聲破碎后，離心(12 000 r/min,15 min,4℃)取上清，BCA測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后，-80℃保存待用。電泳(80 V，40 min；160 V，90 min)結(jié)束后，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)(22 V，28 min)。5%脫脂牛奶封閉120 min,TBST清洗三次，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜。次日，TBST清洗三次，加入相應(yīng)二抗(1∶ 5 000)孵育120 min。TBST清洗三次后，應(yīng)用ECL發(fā)光顯色并拍照。采用Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 消痰化瘀利竅方對(duì)CIH小鼠水迷宮成績(jī)的影響

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Normoxia組相比，中藥對(duì)照組小鼠水迷宮的成績(jī)無明顯變化，CIH組小鼠在隱藏平臺(tái)和反轉(zhuǎn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01，P<0.01)，在空間探索實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)象限時(shí)間百分比明顯下降(P<0.01，P<0.01)，提示CIH可誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力明顯下降。而消痰化瘀利竅方干預(yù)能明顯提高CIH小鼠的水迷宮成績(jī)(P<0.01，圖1，表1)。

Fig. 1 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on Morris water maze performance in mice exposed to CIH

Tab. 1 Time spent in the target quadrant in the probe test (s, n=6)

2.2 消痰化瘀利竅方對(duì)CIH小鼠Y-迷宮成績(jī)的影響

Y-迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Normoxia組相比，中藥對(duì)照組小鼠對(duì)Y-迷宮的成績(jī)無明顯變化，CIH組小鼠總進(jìn)臂次數(shù)無明顯變化，但是正確次數(shù)明顯下降(P<0.01)，而消痰化瘀利竅方干預(yù)能明顯增加CIH小鼠的正確次數(shù)(P<0.01，表2) 。

2.3 消痰化瘀利竅方對(duì)CIH小鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響

尼氏染色結(jié)果顯示，與Normoxia組相比，中藥對(duì)照組海馬尼氏小體數(shù)量無明顯變化，CIH組小鼠海馬神經(jīng)元染色變淺，尼氏小體數(shù)量減少。與CIH組相比，消痰化瘀利竅方干預(yù)可減輕海馬神經(jīng)元的損傷(圖2)。

Tab. 2 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on Y-maze performance in mice exposed to CIH n=6)

Fig. 2 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on hippocampal neuron injury in mice exposed to CIH(Nissl staining ×400)

2.4 消痰化瘀利竅方對(duì)CIH小鼠突觸后致密物厚度的影響

電鏡結(jié)果顯示，與Normoxia組相比，中藥對(duì)照組突觸后致密物質(zhì)的厚度無明顯變化，CIH組小鼠海馬神經(jīng)元突觸后致密物質(zhì)厚度減少，而消痰化瘀利竅方干預(yù)可明顯增加突觸后致密物厚度(圖3)。

Fig. 3 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on postsynaptic density thickness in mice exposed to CIH(Transmission Electron Microscope ×25 000)

2.5 消痰化瘀利竅方對(duì)CIH小鼠海馬神經(jīng)元synapsin和 PSD-95水平的影響

與Normoxia組相比，中藥對(duì)照組海馬synapsin和 PSD-95的表達(dá)無明顯變化，CIH組小鼠PSD-95水平顯著降低(P<0.01)，消痰化瘀利竅方干預(yù)可明顯上調(diào)PSD-95的表達(dá)，與CIH組大鼠相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而synapsin蛋白的表達(dá)在各組之間無明顯差異(圖4，表3)。

Fig. 4 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on synapsin and PSD-95 expressions in hippocampus

Tab. 3 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on synapsin and PSD-95 expressions in hippocampus n=6)

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家有5%～7%的人群患有OSA，而在臨床上超過70%的OSA患者表現(xiàn)出認(rèn)知障礙，如學(xué)習(xí)和記憶功能受損等[11,12]。研究表明，大腦遭受長(zhǎng)期的低氧/復(fù)氧可造成海馬神經(jīng)元的喪失[13]，影響突觸可塑性，進(jìn)而引起記憶能力減退和認(rèn)知功能障礙。本研究通過建立CIH小鼠模型評(píng)估其行為學(xué)的改變，觀察形態(tài)學(xué)以及相關(guān)的分子表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在CIH暴露后，小鼠水迷宮和Y-迷宮成績(jī)明顯下降，尼氏染色顯示海馬神經(jīng)元染色變淺，電鏡觀測(cè)可見突觸后致密物減少，Western結(jié)果顯示PSD-95表達(dá)明顯減少。而給予消痰化瘀利竅方干預(yù)可明顯改善CIH 誘導(dǎo)小鼠的認(rèn)知障礙以及海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的損傷。

水迷宮通常用于評(píng)估空間參考記憶和學(xué)習(xí)功能。與以往研究一致[5]，我們發(fā)現(xiàn)慢性間歇性低氧暴露小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間減少和逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)。消痰化瘀利竅方干預(yù)可明顯提高CIH小鼠的水迷宮成績(jī)。由于工作記憶是記憶執(zhí)行的重要組成部分，聯(lián)合應(yīng)用Y-迷宮評(píng)估小鼠認(rèn)知功能的影響將更為客觀。結(jié)果顯示，消痰化瘀利竅方干預(yù)可明顯增加CIH小鼠在Y-迷宮中的正確進(jìn)臂次數(shù)。提示，消痰化瘀利竅方可以改善CIH誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心與神志密不可分，《素問·靈蘭秘典論》曰“心者，君主之官，神明出焉”。而《素問·脈要精微論》中提出“頭者，精明之府”，《本草備要》也提到“人之記性，皆在腦者”。又把腦與神志、記憶功能聯(lián)系起來。同時(shí)，腦為髓海，心主血脈而藏神，由于精血同源，腦髓與心血互相滋養(yǎng)，正如孫沛所言“故性動(dòng)而靈，腦賴心血養(yǎng)之”[14]。所以祖國醫(yī)學(xué)在治療精神以及認(rèn)知疾病時(shí)常用養(yǎng)血補(bǔ)心，豁痰通竅的方法[15]。消痰化瘀利竅方具有活血祛瘀，豁痰通竅的功效，對(duì)于慢性間歇性低氧引起的認(rèn)知功能障礙恰合病機(jī)。

海馬是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，尤其對(duì)睡眠期間長(zhǎng)時(shí)間的低氧/復(fù)氧非常敏感，該腦區(qū)神經(jīng)元的損傷可導(dǎo)致嚙齒動(dòng)物出現(xiàn)顯著的認(rèn)知缺陷[7,16]。我們通過尼式染色結(jié)果觀測(cè)到消痰化瘀利竅方可改善CIH暴露后的海馬神經(jīng)元損傷。突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)是突觸后膜的一層均質(zhì)致密物，是反映突觸可塑性的形態(tài)學(xué)參數(shù)[17]。我們應(yīng)用透射電鏡觀測(cè)到CIH組小鼠海馬神經(jīng)元突觸后致密物厚度明顯低于對(duì)照組，而消痰化瘀利竅方干預(yù)可明顯增加突觸后致密物厚度。由此可見，消痰化瘀利竅方可能通過改善海馬神經(jīng)元損傷進(jìn)而發(fā)揮對(duì)CIH誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用。

PSD-95是突觸后致密區(qū) (PSD) 的一種重要的神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白，可以與離子通道，膜受體和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子等相互作用，調(diào)節(jié)突觸可塑性[18]。Ehrlich I[9]等認(rèn)為，在學(xué)習(xí)期間PSD-95表達(dá)水平在突觸位點(diǎn)特異性的增加誘導(dǎo)了突觸可塑性的升高。而 PSD-95表達(dá)水平下降則與認(rèn)知障礙密切相關(guān)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CIH暴露可導(dǎo)致PSD-95表達(dá)下調(diào)，而對(duì)突觸素的表達(dá)無明顯影響。消痰化瘀利竅方干預(yù)可明顯上調(diào)CIH暴露小鼠PSD-95的表達(dá)水平。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)給予消痰化瘀利竅方對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力以及突觸可塑性無明顯作用，也不影響synapsin和PSD-95蛋白的表達(dá)。提示消痰化瘀利竅方對(duì)正常小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能無明顯影響。消痰化瘀利竅方是通過上調(diào)CIH誘導(dǎo)的PSD-95表達(dá)下降改善CIH 誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元突觸后可塑性下降，進(jìn)而改善CIH暴露小鼠的認(rèn)知功能障礙。

綜上，消痰化瘀利竅方干預(yù)可通過增加突觸后致密物質(zhì)厚度以及上調(diào)PSD-95蛋白的表達(dá)水平，改善CIH誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙。而針對(duì)OSA“痰、虛、瘀”的中醫(yī)病機(jī)[20]，通過活血祛瘀，豁痰通竅的治法，可為臨床改善OSA誘發(fā)認(rèn)知功能障礙的中醫(yī)藥防治提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。