高糖條件下小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)骨骼肌細(xì)胞成肌分化和胰島素敏感性的影響*

羅 維， 艾 磊， 王博發(fā)， 王俐穎， 甘彥明， 周 越△

(1. 南京體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)健康學(xué)院， 江蘇 南京 210014； 2. 北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)生理學(xué)教研室， 北京 100084； 3. 江蘇省體育科學(xué)研究所， 南京 210033)

研究表明糖尿病是全身慢性炎癥性疾病之一[1]，糖尿病與骨骼肌萎縮間存在惡性循環(huán)[2]，提示機(jī)體慢性炎癥可能通過(guò)抑制骨骼肌再生和重塑誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生發(fā)展[3]。慢性炎癥狀態(tài)下浸潤(rùn)組織的免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞在數(shù)量和功能上都占重要地位[4]，且因其在不同微環(huán)境下可極化為功能迥異的促炎性M1型或抗炎性M2型而成為近年來(lái)代謝性疾病的研究熱點(diǎn)[5-7]。諸多研究證實(shí)巨噬細(xì)胞與骨骼肌細(xì)胞間存在交叉對(duì)話，調(diào)節(jié)骨骼肌再生[8-10]。因此，糖尿病中的高糖環(huán)境可能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化而影響骨骼肌重塑和胰島素敏感性，但尚未得到證實(shí)。

高血糖是2型糖尿病的主要病理特征[11-12]，細(xì)胞共培養(yǎng)體系能更好的模擬體內(nèi)生理環(huán)境來(lái)離體研究不同細(xì)胞間的交叉對(duì)話[13]。胚胎肌球蛋白重鏈(embryonic myosin，E-MHC)是反映成肌細(xì)胞分化狀態(tài)的標(biāo)志蛋白[14-15]。生肌因子5(myogenic factor 5， Myf5)，生肌決定因子(myogenic determination gene， MyoD)和myogenin是成肌細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵調(diào)控蛋白[16-17]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporters 4, GLUT4)是胰島素信號(hào)通路的最終效應(yīng)蛋白[18]。因此，本研究以小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞和成肌細(xì)胞株C2C12細(xì)胞為研究對(duì)象，建立Transwell共培養(yǎng)體系，同時(shí)以60 mmol/L葡萄糖干預(yù)，檢測(cè)C2C12細(xì)胞形態(tài)，活性，E-MHC、GLUT4蛋白表達(dá)，Myf5、MyoD、myogenin基因表達(dá)以及熒光標(biāo)記2-脫氧葡萄糖(2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-13-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose, 2-NBDG)攝取水平，探索離體高糖環(huán)境下小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)骨骼肌細(xì)胞成肌分化和胰島素敏感性的影響。這對(duì)于在體研究糖尿病中巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)骨骼肌重塑和胰島素敏感性的機(jī)制具有更好的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、馬血清(Horse Serum, HS)、青霉素和鏈霉素購(gòu)自Gibco公司；CCK-8購(gòu)自APExBIO公司；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)探針2-NBDG購(gòu)自江蘇凱基公司；兔抗GLUT-4抗體購(gòu)自Abcam公司；鼠抗E-MHC抗體購(gòu)自DSHB公司；小鼠β-actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中山金橋公司；6孔和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、0.4 μm 6孔和24孔 Transwell小室購(gòu)自 Corning 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

C2C12小鼠成肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)，RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。本研究使用膜孔徑0.4 μm的Transwell小室完成RAW264.7細(xì)胞和C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立。

C2C12細(xì)胞隨機(jī)分為單獨(dú)培養(yǎng)組和共培養(yǎng)組，以2×106cells/well密度接種于6孔(或以4×105cells/well密度接種于24孔)Transwell小室的下培養(yǎng)室，每組設(shè)置24個(gè)孔。單獨(dú)培養(yǎng)組上室不接種RAW264.7細(xì)胞，共培養(yǎng)組上室接種RAW264.7細(xì)胞，RAW264.7細(xì)胞接種密度為1.2×106cells/well(6孔板)或2.5×105cells/well(24孔板)。然后單獨(dú)培養(yǎng)組和共培養(yǎng)組組內(nèi)又隨機(jī)分為對(duì)照組和高糖組，共為4組：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)對(duì)照組(SC組，n=12)，共培養(yǎng)對(duì)照組(CC組，n=12)，單獨(dú)培養(yǎng)高糖組(SH組，n=12)，共培養(yǎng)高糖組(CH組，n=12)。對(duì)照組以正常分化液(25 mmol/L葡萄糖DMEM、2%HS、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)，高糖組以含60 mmol/L葡萄糖DMEM的分化液進(jìn)行培養(yǎng)[19]，誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞成肌分化，隔24 h更換分化液。

共培養(yǎng)1 d和3 d后收集下培養(yǎng)室的C2C12細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)(n=6)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

RAW264.7細(xì)胞和C2C12細(xì)胞采用細(xì)胞生長(zhǎng)液(DMEM培養(yǎng)基、100 ml/L FBS、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)，在37℃、50 ml/L CO2孵育箱中培養(yǎng)。依細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，1～2 d傳代1次。待細(xì)胞增殖傳代到足夠細(xì)胞量后統(tǒng)一凍存，選取同一代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

每天在相差顯微鏡下觀察C2C12細(xì)胞形態(tài)并采集圖像。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性

以1.2中分組和時(shí)間點(diǎn)處理細(xì)胞后，收集接種于24孔板下培養(yǎng)室的C2C12細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。收細(xì)胞時(shí)每孔加入10 μl CCK-8，混勻，于孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀中檢測(cè)各孔450 nm處的吸光度值(A450)。根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞活性：細(xì)胞活性%=(A實(shí)驗(yàn)處理孔-A空白孔)/(A對(duì)照孔-A空白孔)×100%，每個(gè)樣本重復(fù)3次，檢測(cè)高糖作用下巨噬細(xì)胞對(duì)骨骼肌細(xì)胞活性的影響。

1.5 2-NBDG法檢測(cè)C2C12細(xì)胞糖攝取水平

2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose, 2-DG)是天然D型葡萄糖衍生物，通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞，2-DG第2位氧原子被熒光基團(tuán)NBD取代形成2-DG的熒光類似物, 即2-NBDG。2-NBDG激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)為540 nm, 能夠被熒光酶標(biāo)儀探測(cè)。

以1.2中分組和時(shí)間點(diǎn)處理細(xì)胞后，收集接種于24孔板下培養(yǎng)室的C2C12細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。收細(xì)胞時(shí)常溫PBS洗一次，每孔加入1 ml含2%牛血清白蛋白的無(wú)糖DMEM，孵育3 h，每組細(xì)胞在組內(nèi)隨機(jī)分為胰島素組和PBS組，以1 μl/ml濃度的胰島素或PBS干預(yù)30 min后避光條件下加入3 μl/well 2-NBDG，孵育30 min，預(yù)冷PBS洗兩遍后再次加入200 μl/well PBS,于熒光酶標(biāo)儀中讀取熒光值。根據(jù)2-NBDG濃度(ng/ml)與熒光值標(biāo)準(zhǔn)曲線中生成的公式計(jì)算細(xì)胞攝取2-NBDG的相對(duì)值，單位為ng/ml。

1.6 免疫熒光檢測(cè)C2C12細(xì)胞E-MHC和GLUT4蛋白表達(dá)

將經(jīng)過(guò)滅菌消毒處理的玻片置于6孔Transwell小室的下培養(yǎng)室，將C2C12細(xì)胞接種于玻片上進(jìn)行細(xì)胞爬片，待接種24 h細(xì)胞貼壁后以1.2中分組處理細(xì)胞，干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。

按1.2中分組處理細(xì)胞3 d后收集細(xì)胞，1 ml 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，5%羊血清封閉1 h；5%羊血清配制GLUT4和E-MHC一抗，濃度分別為1/100和1/200，孵育過(guò)夜，5%羊血清配制山羊抗兔紅色二抗和山羊抗鼠綠色二抗，濃度均為1/200，孵育2 h；加入DAPI染液避光室溫孵育10 min。爬片取出稍甩干后將有細(xì)胞的一面朝下用抗熒光淬滅封片劑將玻片封固在載玻片上封片，避光儲(chǔ)存于4°C。激光共聚焦顯微鏡采集圖像，觀察細(xì)胞中E-MHC和GLUT4的表達(dá)情況。采用Image Pro Plus 6.0軟件處理圖像，計(jì)算E-MHC陽(yáng)性面積和GLUT4相對(duì)熒光值。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)C2C12細(xì)胞Myf5、MyoD和myogenin水平

以1.2中分組和時(shí)間點(diǎn)處理細(xì)胞后，采用1 mL Trizol裂解細(xì)胞，細(xì)胞懸液吸入1.5 ml EP管裂解25 min，4℃離心取上清。加入氯仿0.2 ml，劇烈振蕩搖晃15 s后，靜置30 min。4℃離心取上端無(wú)色部分，加入等體積異丙醇-20℃放置25 min，4℃離心留沉淀。分光光度計(jì)測(cè)濃度，試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA在-20℃儲(chǔ)存待用。

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物：Myf5-F: TTTCGAGACGCTCAAGAGGT, Myf5-R: CAGACAGGGCTGTTACATTCA；MyoD-F: CGCCTGAGCAAAGTGAATG, MyoD-R: AGACCTTCGATGTAGCGGAT;myogenin-F: AGGTGTGTAAGAGGAAGTCTGTGTC, myogenin-R: TTGGGGTTGAGCAGGGTG；β-actin-F: CGTTGACATCCGTAAAGACCTC，β-actin-R: ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG。以cDNA(1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成20 μl cDNA)2 μl、濃度為10 μmol/L的上游引物和下游引物各0.5 μl、2×SYBR?Green酶10 μl和滅菌ddH2O 7 μl進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件為 95℃ 30 s變性，95℃ 5 s、60℃ 40 s(40個(gè)循環(huán))擴(kuò)增。95℃ 10 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s建立PCR產(chǎn)物熔解曲線，分析擴(kuò)增曲線，計(jì)算Ct值。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算各組間mRNA表達(dá)水平差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高糖條件下巨噬細(xì)胞對(duì)C2C12細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置相差顯微鏡下觀察不同干預(yù)后C2C12細(xì)胞形態(tài)(圖1，見彩圖頁(yè)Ⅴ)，SC組細(xì)胞誘導(dǎo)分化第3日出現(xiàn)匯聚融合，并有肌管形成(圖中紅色箭頭標(biāo)識(shí)處)。CC組誘導(dǎo)分化1 d后出現(xiàn)細(xì)小肌管，誘導(dǎo)分化3 d后肌管數(shù)量明顯增多。SH組干預(yù)1 d后長(zhǎng)出細(xì)絲(圖中藍(lán)色箭頭標(biāo)識(shí)處)，干預(yù)3 d后出現(xiàn)細(xì)小肌管，但肌管體積明顯小于SC組和CC組。CH組干預(yù)1 d后出現(xiàn)較SH組更多的細(xì)絲，干預(yù)3 d后未見明顯肌管形成。以上形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)C2C12成肌分化，高糖干預(yù)3 d抑制C2C12成肌分化，高糖環(huán)境下與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)一步抑制C2C12成肌分化。

2.2 高糖條件下巨噬細(xì)胞對(duì)C2C12細(xì)胞活性的影響

CCK-8檢測(cè)不同干預(yù)后C2C12細(xì)胞活性(表1)，結(jié)果顯示干預(yù)1 d后各組間細(xì)胞活性無(wú)顯著差異(P>0.05)；干預(yù)3 d后CC組和SH組均與SC組無(wú)顯著差異(P>0.05)，但CH組顯著低于CC組(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，本研究中與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)或高糖干預(yù)3 d均未影響C2C12細(xì)胞活性，但高糖環(huán)境下與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)3 d導(dǎo)致細(xì)胞活性下降。

Tab. 1 The changes of the activity in C2C12 cells under different treatments (%, n=6)

2.3 高糖條件下巨噬細(xì)胞對(duì)C2C12細(xì)胞成肌分化的影響

成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，C2C12細(xì)胞通過(guò)不斷融合，匯聚為多核肌管，因此本研究通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)不同干預(yù)3 d后C2C12細(xì)胞E-MHC蛋白表達(dá)(圖2，見彩圖頁(yè)Ⅵ)。根據(jù)E-MHC陽(yáng)性面積與視野總面積比值計(jì)算C2C12細(xì)胞融合率來(lái)反映成肌細(xì)胞分化情況。結(jié)果顯示，CC組細(xì)胞融合率為(44.17±4.80)%，顯著高于SC組(23.33±3.51)%(P<0.01)，CH組細(xì)胞融合率為(10.17±2.52)%，顯著低于CC組(P<0.01)和SH組(18.32± 2.52)%(P<0.05)。以上結(jié)果顯示，與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)明顯促進(jìn)C2C12融合為肌管，高糖干預(yù)對(duì)C2C12融合率無(wú)顯著影響，但高糖環(huán)境下與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)明顯抑制C2C12融合和肌管的形成。

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)成肌調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的影響(表2)，結(jié)果顯示，與同時(shí)間點(diǎn)的SC組相比， CC組干預(yù)1 d后和3 d后MyoD和myogenin表達(dá)顯著增加(P<0.05)，Myf5表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)；SH組干預(yù)1 d后Myf5、MyoD和myogenin表達(dá)均無(wú)顯著變化，3 d后Myf5、MyoD和myogenin表達(dá)均顯著下降(P<0.05)。CH組干預(yù)1 d后myogenin表達(dá)顯著低于CC組(P<0.01)，干預(yù)3 d后Myf5、MyoD和myogenin表達(dá)均顯著低于CC組(P<0.01)，myogenin表達(dá)還顯著低于SH組。以上結(jié)果顯示，與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)明顯促進(jìn)C2C12 MyoD和myogenin基因表達(dá)，高糖干預(yù)3 d后明顯抑制Myf5、MyoD和myogenin基因表達(dá)。高糖環(huán)境下與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)3 d后進(jìn)一步抑制Myf5、MyoD和Myogenin基因表達(dá)。

Tab. 2 The changes of relative mRNA expression in C2C12 cells under different treatments n=6)

2.4 高糖條件下巨噬細(xì)胞對(duì)C2C12細(xì)胞糖攝取的影響

2-NBDG法檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)C2C12細(xì)胞基礎(chǔ)的和胰島素刺激的糖攝取的影響(表3)，結(jié)果顯示，干預(yù)第1日胰島素刺激下SC組、CC組和SH組2-NBDG攝取量均顯著高于相應(yīng)的PBS組(P<0.05)，CH組與PBS組無(wú)顯著差異(P>0.05)，干預(yù)3 d后胰島素刺激下SC組、CC組2-NBDG攝取量均顯著高于PBS組(P<0.05)， SH組和CH組與PBS組無(wú)顯著差異(P>0.05)。基礎(chǔ)2-NBDG攝取量檢測(cè)中，干預(yù)第1日CH組顯著低于CC組(P<0.05)，干預(yù)第3日SH組顯著低于SC組(P<0.05)、CH組顯著低于CC組(P<0.01)。胰島素刺激的2-NBDG攝取量檢測(cè)中，干預(yù)第1日CH組顯著低于SH組(P<0.05)，干預(yù)第3日CC組和SH組均顯著低于SC組(P< 0.05)，CH組顯著低于CC組和SH組(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)提高C2C12細(xì)胞中胰島素刺激的糖攝取，進(jìn)而提高C2C12細(xì)胞的胰島素敏感性；高糖干預(yù)3 d后抑制C2C12細(xì)胞基礎(chǔ)糖攝取和胰島素刺激的糖攝取，高糖環(huán)境中與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)導(dǎo)致C2C12細(xì)胞的基礎(chǔ)糖攝取和胰島素刺激的糖攝取進(jìn)一步下降，產(chǎn)生胰島素抵抗。

Tab. 3 The changes of 2-NBDG transport (ng/ml) and GLUT4 relative fluorescence (%) in C2C12 cells under different treatments n=6)

2.5 高糖條件下巨噬細(xì)胞對(duì)C2C12細(xì)胞GLUT4表達(dá)的影響

免疫熒光染色檢測(cè)不同干預(yù)3 d后C2C12細(xì)胞基礎(chǔ)的和胰島素刺激的GLUT4蛋白表達(dá)并計(jì)算熒光值(圖3，表3)。檢測(cè)結(jié)果顯示，胰島素刺激下SC組和CC組GLUT4熒光水平均顯著高于PBS組(P<0.05)，而SH組和CH組與PBS組無(wú)顯著差異(P>0.05)?；A(chǔ)GLUT4檢測(cè)中SH組顯著低于SC組，CC組顯著高于SC組，CH組顯著低于CC組和SH組(P<0.05)。胰島素刺激的GLUT4檢測(cè)中SH組顯著低于SC組，CH組顯著低于CC組(P<0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明，與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)提高C2C12細(xì)胞的基礎(chǔ)GLUT4蛋白表達(dá)量，高糖刺激抑制C2C12細(xì)胞基礎(chǔ)的和胰島素刺激的GLUT4蛋白表達(dá)量，高糖環(huán)境下與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)一步抑制C2C12細(xì)胞的GLUT4蛋白表達(dá)量，產(chǎn)生胰島素抵抗(圖3，見彩圖頁(yè)Ⅵ)。

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的炎癥細(xì)胞[4-7]，骨骼肌是胰島素作用的靶器官，也是人體胰島素抵抗發(fā)生的主要部位[20-21]。諸多研究證實(shí)巨噬細(xì)胞與骨骼肌細(xì)胞間存在交叉對(duì)話，調(diào)節(jié)骨骼肌再生與代謝[8-10]。由此可見糖尿病發(fā)生發(fā)展中的高血糖環(huán)境可能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化來(lái)影響骨骼肌重塑和骨骼肌胰島素敏感性，進(jìn)而推動(dòng)糖尿病的進(jìn)一步發(fā)展。本研究以小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞和小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞株C2C12細(xì)胞建立Transwell共培養(yǎng)體系，同時(shí)以60 mmol/L葡萄糖進(jìn)行離體干預(yù)，檢測(cè)不同干預(yù)下C2C12細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、細(xì)胞融合率、成肌調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)、2-NBDG攝取水平以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的變化，探索高糖條件下小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)骨骼肌細(xì)胞成肌分化和胰島素敏感性的影響。

研究表明生理水平的炎癥有利于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活，促進(jìn)骨骼肌重塑[22-23]，本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞明顯加快骨骼肌細(xì)胞成肌分化進(jìn)程，促進(jìn)肌管融合，這與上述研究結(jié)果一致。同時(shí)，本研究還觀察到高糖處理抑制C2C12細(xì)胞融合和多核肌管形成，而高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞的參與進(jìn)一步抑制C2C12細(xì)胞多核肌管的形成，且細(xì)胞活性下降，從形態(tài)學(xué)上提示生理?xiàng)l件下巨噬細(xì)胞促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞激活與融合，但高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞抑制骨骼肌細(xì)胞融合和多核肌管的形成。

E-MHC是新生肌纖維特有的結(jié)構(gòu)蛋白，是反應(yīng)細(xì)胞分化狀態(tài)和細(xì)胞融合率的標(biāo)志性指標(biāo)。細(xì)胞增殖期內(nèi)E-MHC表達(dá)極少，隨著細(xì)胞融合匯聚E-MHC陽(yáng)性面積隨之增加[14-15]。Myf5、MyoD和myogenin為成肌調(diào)節(jié)因子家族成員，是成肌細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，Myf5為激活狀態(tài)下成肌細(xì)胞增殖的標(biāo)志，MyoD和Myogenin均為激活狀態(tài)下成肌細(xì)胞分化的標(biāo)志[16-17]。本研究中正常糖濃度下巨噬細(xì)胞明顯促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞中E-MHC陽(yáng)性面積增加和成肌分化標(biāo)志基因MyoD和myogenin表達(dá)，但高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞的參與則導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞E-MHC陽(yáng)性面積明顯下降，明顯抑制Myf5、MyoD和Myogenin基因表達(dá)，抑制骨骼肌細(xì)胞激活和分化，這從基因和蛋白層面證實(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，共同說(shuō)明生理?xiàng)l件下巨噬細(xì)胞促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞成肌分化，但高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞的這一促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)，反過(guò)來(lái)抑制骨骼肌細(xì)胞成肌分化。

體內(nèi)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取中80%由骨骼肌完成，且骨骼肌是胰島素抵抗發(fā)生的主要部位[20-21]，因此，本研究進(jìn)一步探索高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞在抑制骨骼肌細(xì)胞成肌分化的同時(shí)是否影響骨骼肌細(xì)胞的胰島素敏感性。2-NBDG通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中熒光強(qiáng)度能較好的反應(yīng)一定時(shí)長(zhǎng)內(nèi)細(xì)胞的糖攝取能力，是目前研究離體胰島素敏感性的常用手段[24]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常糖濃度下巨噬細(xì)胞可提高骨骼肌細(xì)胞中胰島素刺激的2-NBDG攝取，進(jìn)而提高骨骼肌細(xì)胞的胰島素敏感性，但高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞反過(guò)來(lái)抑制骨骼肌細(xì)胞的基礎(chǔ)2-NBDG攝取和胰島素刺激的2-NBDG攝取，出現(xiàn)胰島素抵抗。

作為胰島素通路的最終效應(yīng)蛋白，GLUT4對(duì)于維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)具有關(guān)鍵作用，是研究胰島素抵抗的重要靶點(diǎn)，胰島素抵抗發(fā)生時(shí)GLUT4激活明顯減少[18]。由于胰島素刺激細(xì)胞攝取葡萄糖主要依賴于GLUT4蛋白的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)[25]，因此本文通過(guò)免疫熒光方法觀察GLUT4在肌細(xì)胞中的表達(dá)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常糖濃度下巨噬細(xì)胞可提高骨骼肌細(xì)胞中GLUT4蛋白表達(dá)，但高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞反過(guò)來(lái)抑制骨骼肌細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)，降低骨骼肌細(xì)胞胰島素敏感性。

綜上所述，本研究從骨骼肌細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞融合率、成肌調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)、基礎(chǔ)與胰島素刺激的2-NBDG攝取和GLUT4蛋白表達(dá)5個(gè)方面證實(shí)正常葡萄糖濃度下與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)C2C12細(xì)胞成肌分化并提高胰島素敏感性，但60 mmol/L葡萄糖作用下這一促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)，RAW264.7細(xì)胞反過(guò)來(lái)抑制C2C12成肌分化并誘發(fā)胰島素抵抗。提示我們巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)著骨骼肌細(xì)胞成肌分化與代謝，并參與高糖環(huán)境對(duì)骨骼肌細(xì)胞再生與代謝的調(diào)節(jié)作用。本研究一方面為在體研究糖尿病發(fā)生發(fā)展中巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)骨骼肌重塑和胰島素敏感性的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和借鑒，另一方面對(duì)糖尿病等慢性代謝性疾病治療靶點(diǎn)的尋找具有重要理論意義。