當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠氣道黏液高分泌及TNF-α/NF-κB信號(hào)通路的影響*

姚 楠， 韋凌霞， 王志旺,2△， 丁茂鵬， 付曉艷， 龐亞蓉， 程小麗， 藺興遙,2， 邵 晶△

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 蘭州 730000; 2. 甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730000)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是全球最常見的氣道慢性炎癥性疾病，氣道炎癥與黏液高分泌是哮喘的基本病理特征[1]，黏液高分泌表現(xiàn)為杯狀細(xì)胞明顯增生和黏液產(chǎn)生增多，過度的黏液分泌將會(huì)阻塞氣道，從而增加哮喘患者死亡率[2]?！侗窘?jīng)》記載當(dāng)歸“主咳逆上氣”，《本草蒙筌》及《本草匯編》指出當(dāng)歸“味兼辛散，為血中氣藥”、“血藥補(bǔ)陰，血和而氣降”，故后世醫(yī)家臨床上多配伍當(dāng)歸用于治療陰虛哮喘，緩解患者的哮喘癥狀及咽干口燥、形體消瘦、潮熱盜汗等陰虛癥狀。藥理研究顯示當(dāng)歸有明顯的平喘作用[3]。本實(shí)驗(yàn)采用卵蛋白與甲狀腺?gòu)?fù)制陰虛哮喘動(dòng)物模型，研究當(dāng)歸對(duì)陰虛證哮喘小鼠的哮喘癥狀、Muc5ac表達(dá)的影響，并從TNF-α/NF-κB信號(hào)通路的角度探討當(dāng)歸治療陰虛哮喘的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

甘肅岷縣采挖當(dāng)歸，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為Angelicasinensis(Oliv.) Diels，產(chǎn)品批號(hào)：20171021。將新鮮當(dāng)歸于陰涼處晾干，悶潤(rùn)后切片，陰干得當(dāng)歸飲片；取當(dāng)歸100 g分別加入10倍、8倍量純凈水，分別煎煮60 min、45 min，合并濾液，濃縮至1.0 g/ml，冷藏1周內(nèi)使用。鹽酸氨溴索片，山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20010425，產(chǎn)品批號(hào)18011502。卵清白蛋白(OVA)，Grade V Sigma公司，批號(hào)SLBF0342V。甲狀腺片，山東中泰藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37021712，批號(hào)17110101。TNF-α、IgE ELISA試劑盒，南京建成生物工程研究所，產(chǎn)品批號(hào)20180701、20180602；Muc5ac、NF-κB測(cè)試盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：180701W、180612W；NF-κB p65、IκB antibody，美國(guó)南加州Genetex公司，批號(hào)：821806152、8118071552。

1.2 儀器

GYD-CHT型鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系統(tǒng)(CH Technologies公司)；402AI型超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；蛋白電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；QuantStudio 5型定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠，昆明種SPF級(jí)，體重18～22 g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證：SCXK(甘)2015-0002，設(shè)施許可證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理

將72只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組(n=12)：模型對(duì)照組(Model)、氨溴索組(Ambroxol, 20 mg/kg)以及當(dāng)歸高、中、低劑量組(RADA-H、8 g/kg體重；RADA-M、4 g/kg體重；RADA-L、2 g/kg體重)。實(shí)驗(yàn)第1日起開始致敏，參考文獻(xiàn)方法[4]，小鼠每只皮下注射新鮮配制的致敏液0.2 ml(將20 μg OVA與2 mg氫氧化鋁混懸于生理鹽水即得)，同時(shí)間空白對(duì)照組(Control)每只皮下注射生理鹽水0.2 ml；第8日依上法再次致敏。從第15日開始激發(fā)哮喘，將小鼠置于吸入染毒系統(tǒng)中，吸入超聲霧化激發(fā)液(1% OVA生理鹽水混懸液)20 min，1次/天，連續(xù)14 d，空白對(duì)照組以生理鹽水代替激發(fā)液。每次激發(fā)3 h后各組小鼠灌胃甲狀腺片120 mg/kg體重(以0.5%黃原膠助懸)，空白對(duì)照組灌胃等量0.5%黃原膠。從實(shí)驗(yàn)第15日開始，各組小鼠于激發(fā)前3 h按上述劑量灌胃給藥20 ml/kg體重，其中空白對(duì)照組與模型對(duì)照組灌胃等量純凈水，1次/天，連續(xù)14 d。

1.5 測(cè)評(píng)哮喘癥狀

參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法[5]，實(shí)驗(yàn)第27日，配制含2% OVA新鮮激發(fā)液，將小鼠置于超聲霧化染毒箱中2 min，超聲霧化吸入激發(fā)液(2% OVA生理鹽水混懸液)，支氣管激發(fā)后觀察小鼠在10 min內(nèi)上呼吸道癥狀(打噴嚏與抓鼻子)與哮喘發(fā)作程度并評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：小鼠無(wú)哮喘癥狀記0分；小鼠有輕微的哮喘癥狀記3分；小鼠出現(xiàn)呼吸頻率與幅度明顯加大、煩躁不安或靜止不動(dòng)等癥狀記6分；小鼠出現(xiàn)腹式呼吸或急促點(diǎn)頭等嚴(yán)重的哮喘癥狀記9分。

1.6 測(cè)定相關(guān)活性因子及相關(guān)蛋白表達(dá)的指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)第29日戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，股靜脈取血，分離血清，采用ELISA法測(cè)定IgE含量。處死小鼠后手術(shù)暴露氣管，結(jié)扎左支氣管；將塑料軟管(外徑約1 mm)從小鼠口腔插入氣管，連接1 ml注射器，將小鼠頭朝上身體與水平面呈45°夾角固定后，用37℃生理鹽水反復(fù)灌洗，每次0.2 ml，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)，2000 r/min離心10 min，分取BALF上清液測(cè)定TNF-α含量。取左肺組織，經(jīng)多聚甲醛固定后切片，進(jìn)行免疫組化染色，觀察肺組織Muc5ac、NF-κB表達(dá)特點(diǎn)并進(jìn)行半定量分析；另取肺組織采用WB法測(cè)定NF-κB p65、IκB表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸對(duì)小鼠哮喘癥狀的影響

在OVA激發(fā)過程中，小鼠的上呼吸道癥狀(打噴嚏與抓鼻子)明顯加重，激發(fā)后出現(xiàn)不同程度的哮喘癥狀。在激發(fā)的第13日，模型對(duì)照組小鼠的上呼吸道癥狀與哮喘發(fā)作程度顯著加重，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在當(dāng)歸的干預(yù)下，小鼠的上呼吸道癥狀與哮喘發(fā)作程度明顯得到緩解，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

Tab. 1 Effects of RADA on asthma symptoms in mice n=12)

2.2 當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠IgE、TNF-α的影響

模型對(duì)照組小鼠血清IgE、BALF中TNF-α含量顯著升高，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)；當(dāng)歸各劑量組IgE、TNF-α明顯下降，與模型對(duì)照組組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Effects of RADA on IgE and TNF-α in Yin-deficiency asthma mice n=12)

2.3 當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠氣道Muc5ac表達(dá)的影響

在400倍光鏡下Muc5ac被染成藍(lán)紫色顆粒狀，肺組織Muc5ac主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞及氣道內(nèi)(圖1A)。陰虛哮喘模型組氣道Muc5ac的表達(dá)顯著增強(qiáng)并向氣道內(nèi)延伸(圖1B)，在當(dāng)歸的干預(yù)下其表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱(圖1D～F)。對(duì)Muc5ac的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Muc5ac表達(dá)的平均光密度值有顯著差異；與模型對(duì)照組比較，當(dāng)歸各劑量組能明顯降低Muc5ac表達(dá)的平均光密度值(P<0.01，圖1，表3)。

Fig. 1 Immunohistochemical results of Muc5ac expression level in mouse airway (×40)

2.4 當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠肺組織NF-κB表達(dá)的影響(免疫組化法)

在400倍光鏡下，NF-κB p65被染成棕黃色，主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞與炎癥細(xì)胞的細(xì)胞核中。NF-κB p65在空白對(duì)照組小鼠肺組織呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖2A)，但在模型對(duì)照組中的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖2B)，在當(dāng)歸的干預(yù)下其表達(dá)明顯減弱(圖2D～F)。半定量分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組NF-κB p65表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，當(dāng)歸各劑量組NF-κB p65的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2，表3)。

Fig. 2 Immunohistochemical analysis of NF-κB expression in mice lung tissue (×40)

Tab. 3 Effects of RADA on Muc5ac and NF-κB expressions in lung tissues of Yin-deficiency asthmatic mice n=12)

2.5 當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠肺組織NF-κB表達(dá)的影響(WB法)

在蛋白相對(duì)分子質(zhì)量65 KD、62 KD和45 KD處有表達(dá)條帶，分別為NF-κB p65、IκB與β-actin。半定量分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，哮喘模型組NF-κB p65、IκB蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)。經(jīng)當(dāng)歸干預(yù)后NF-κB p65、IκB蛋白表達(dá)明顯減弱，其中當(dāng)歸高、中劑量組與哮喘模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3，表4)。

Fig. 3 Effects of RADA on NF-κB and IκB expressions in lung tissue of Yin-deficiency asthmatic mice (Western blot)

Tab. 4 Effects of RADA on NF-κB expression in lung tissue of Yin-deficiency asthmatic mice n=12)

3 討論

自《本經(jīng)》謂當(dāng)歸“主咳逆上氣”以來(lái)，歷代中醫(yī)藥著作多有闡述當(dāng)歸防治呼吸系統(tǒng)疾病的理論與臨床應(yīng)用。當(dāng)歸補(bǔ)血活血、和血降氣，在“血藥養(yǎng)陰”理論指導(dǎo)下經(jīng)常用于治療陰虛哮喘，如金水六君煎、百合固金湯等經(jīng)典名方中均配伍當(dāng)歸治療陰虛型哮喘。支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是呼吸系統(tǒng)的常見病，有多種炎癥細(xì)胞參與[6]。炎癥反應(yīng)是哮喘的基礎(chǔ)病理特征，炎癥引起氣道上皮充血水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥活性物質(zhì)(包括IgE)釋放增多，臨床上患者出現(xiàn)咳嗽、喘息甚至哮喘等癥狀[7]。哮喘炎癥反應(yīng)改變了氣道微環(huán)境，引起氣道上皮杯狀細(xì)胞增生及黏蛋白的高表達(dá)，由此引起的黏液高分泌亦是哮喘的病理特征之一。陰虛型哮喘氣道產(chǎn)生更加黏稠的黏液粘結(jié)于氣道，難以咳出而引發(fā)反復(fù)的咳嗽；同時(shí)黏液裹挾哮喘炎癥介質(zhì)并滯留于氣道，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，引發(fā)氣道高反應(yīng)性及其重構(gòu)；急性重癥哮喘產(chǎn)生的黏液積聚堵塞氣道，引起呼吸窘迫甚至死亡[8-9]。本次研究采用卵清白蛋白與甲狀腺制備陰虛哮喘模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)歸能改善哮喘發(fā)作癥狀，緩解打噴嚏、抓鼻子等哮喘引起的上呼吸道癥狀，這為當(dāng)歸及其復(fù)方治療哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病提供有力的支持。同時(shí)，當(dāng)歸能緩解哮喘氣道組織黏蛋白5ac(Muc5ac)的高表達(dá)，改善氣道黏液高分泌。氣道黏液對(duì)氣道有保護(hù)、潤(rùn)濕及清潔作用，但在病理狀態(tài)下，黏液過多或過于黏稠而粘滯于氣道，作為病理產(chǎn)物而影響肺換氣，當(dāng)歸可抑制氣道黏蛋白的表達(dá)，這為當(dāng)歸祛痰而治療哮喘提供依據(jù)。

氣道黏液主要是由水與黏蛋白等組成的半膠凍狀流體，而決定其粘稠度的主要是黏蛋白。氣道黏蛋白由杯狀細(xì)胞、黏膜下腺體及氣道上皮細(xì)胞分泌，主要包括黏蛋白5ac(Muc5ac)、黏蛋白5b(Muc5b)及黏蛋白2(Muc2)等，哮喘氣道黏蛋白以杯狀細(xì)胞分泌的Muc5ac為主且隨病情的加重而分泌迅速增加，故杯狀細(xì)胞分泌的Muc5ac是哮喘氣道黏液粘稠度的決定性因素[10]。近年來(lái)研究顯示，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路異常激活與哮喘氣道黏液高分泌有密切的關(guān)系[11]。TNF-α由Th2細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放，能增加中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附[12]。與TNF受體相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2, TRAF2)結(jié)合后，能促使I-κB激酶(I-κB kinase, IKK)磷酸化IκB，活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核而促進(jìn)Muc5ac基因的表達(dá)，加速M(fèi)uc5ac的合成與分泌[13]。本次研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸在治療哮喘過程中可降低BALF中TNF-α的水平，抑制肺組織NF-κB及IκB的表達(dá)，提示當(dāng)歸平喘、緩解氣道黏液高分泌的作用與抑制TNF-α/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。綜上可見，當(dāng)歸具有明顯的平喘作用，機(jī)制與其抑制TNF-α/NF-κB通路和黏蛋白5ac表達(dá)有關(guān)。